现代生物学大实验本科生

1、质粒DNA的提取、扩增和鉴定实验目的实验目的 学习质粒的相关基本知识； 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从大小从1-200kb不等，为双链、闭环的不等，为双链、闭环的DNA分分子，并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。子，并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质

2、粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。常见的天然质粒有抗生素的抗性等。常见的天然质粒有F质粒质粒(又又称称F因子或性质粒因子或性质粒)、R质粒和质粒和Col质粒。质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型松驰控制型(Relaxed control) 前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。 后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一

3、般在 20 个以上，如 Col质粒。一个理想的质粒克隆载体应具有的特性一个理想的质粒克隆载体应具有的特性:（1）分子量小；）分子量小；（2）多拷贝、松驰控制型；）多拷贝、松驰控制型；（3）具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位）具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点点,即多克隆位点即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites)；（4）能插入较大的外源）能插入较大的外源DNA片段；片段；（5）具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、）具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）常用的质粒载体大小一般在常用的质粒载体大小一般在

4、1kb至至10kb之间，之间，克隆载体如克隆载体如:pGEM-T、pUCm-T和和pBluescript（简称（简称pBS）等）等 ，表达载体如，表达载体如:p1300质粒等质粒等质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。常用的质粒载体可以分为克隆载体和表达载体pBluescript II高速冷冻离心机高速冷冻离心机（1）取液体培养菌液）取液体培养菌液10 mL 置离心管中，置离心管中，10 000r/min 离心离心10min 去掉上清液。加入去掉上清液。加入150L 的的GET缓冲液，充分混匀，在室温下放缓冲液，充分混匀，在室温下放置置10min。（2）加入）加入200

5、L 新配置的新配置的0.2mol/L NaOH，1%SDS。加盖，颠倒。加盖，颠倒2 3 次使之次使之混匀。冰上放置混匀。冰上放置5 min。SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。质粒质粒DNA的提取步骤的提取步骤（3）加）加150L 冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置匀，冰上放置15 min。10000r/min离心离心5min，上，上清液倒入另一离心管中。清液倒入另一离心管中。乙酸钾能沉淀乙酸钾能沉淀SDS和和SDS与蛋白质的复合物。与蛋白质的复合物。在冰上放置在冰上放置15min是为了使沉淀完全。是为了使沉淀完

6、全。（4）向上清液中加入等体积酚）向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，氯仿，震荡混匀，10 000r/min 离心离心2min，将上清液转移至新的离心管中。，将上清液转移至新的离心管中。（5）向上清液中加入）向上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放倍体积无水乙醇，混匀，室温放置置2 min。离心。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体，然后加入倒扣在吸水纸上，吸干液体，然后加入50L的的TE缓冲缓冲液保存。液保存。Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension1.1.按照

7、如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试管中按顺序加入各试剂剂 并混匀：并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水补充至 25.0 L操作步骤操作步骤反应完成后反应完成后, ,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀例混匀, ,上样电泳。上样电泳。操作步骤操作步骤琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的

8、材料: 琼脂糖电泳琼脂糖电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳一、实验目的一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与电荷效应与分子筛效应分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理二、实验原理琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使

9、其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项：注意事项：EBEB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，实验材料、器具及药品实验材料、器具及药品 实验中提取的质粒样品。实验中提取的质粒样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波电泳仪，电泳槽，电子天平，

10、移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，琼脂糖，1XTAE1XTAE电泳缓冲液电泳缓冲液，溴化乙锭（，溴化乙锭（EBEB），），10X10X载样缓冲液载样缓冲液 实验步骤实验步骤 0.5g 琼脂糖加入50ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 用胶带将制胶板两端封好，用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子插入适当梳子，将，将溶解的琼脂糖中加入溶解的琼脂糖中加入0.5ml EB0.5ml EB（约（约5050）倒）倒入，室温冷却凝固。入，室温冷却凝固。 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，

11、加槽中，加1 1TAETAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。，小心垂直向上拔出梳子。 用移液器吸取用移液器吸取4l 4l 样品溶解液，混匀后，样品溶解液，混匀后，小小心加入点样孔心加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至3-5V/cm3-5V/cm，可见到，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约40min-60min40min-60min。（6）将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。质粒质粒DNADNA应呈现二或三条不同构型的条带，应呈现二或三条不同

12、构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的是样品中存有的RNARNA杂质。若质粒杂质。若质粒DNADNA样品在样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNADNA样品中有细菌的染色体样品中有细菌的染色体DNADNA污染。污染。（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。琼脂糖电泳的优点v 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 琼

13、脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围 开环(部分解链 )闭环(螺旋) 闭环(超螺旋)质粒DNA1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。质，尤其是动力学性质作初步的研究。酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖

14、酶的提取及其性质研究 自自1860年年Bertholet从啤酒酵母（从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（蔗糖酶（invertase）（）（-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的）特异地催化非还原糖中的-呋喃果糖糖苷键水呋喃果糖糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和

15、果糖。 实验原理 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶内蔗糖酶，含有少量的糖。两种，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个

16、氨基酸，成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和和Met，它们，它们的分子量也不同，外酶约为的分子量也不同，外酶约为27万万(或或22万，与酵母的来源有关万，与酵母的来源有关)，内酶约为内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。主要是外酶。名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km p

17、I 最适pH 稳定pH 最适温度外酶 27万 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60 内酶13.5万 3% 双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。数。两种酶的性质对照表如下两种酶的性质对照表如下：一、蔗糖酶的提取与部分纯化一

18、、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量 的测定的测定 本实验分三个方面实验：本实验分三个方面实验：细胞破壁的几种方法细胞破壁的几种方法1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒

19、形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。（一）蔗糖酶的提取与部分纯化（一）蔗糖酶的提取与部分纯化 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。（2）称取）称取3g干啤酒酵母，称干啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约蜗牛酶及

20、适量（约3g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。（3）量取预冷的甲苯）量取预冷的甲苯6ml+6ml缓慢加入酵母中，边加边研磨缓慢加入酵母中，边加边研磨成成糊状糊状，约需，约需40分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。母细胞大部分研碎。（4）缓慢加入预冷的）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加去离子水，每次加2ml左右，边加左右，边加边研磨，至少用边研磨，至少用20分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心）

21、将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，机离心，4，5000rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中。的离心管中。操作步骤操作步骤 4，5000rpm，离心，离心15min。 （7）将上清液转入量筒，量出体积，留出）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8

22、）用广泛）用广泛pH试纸检查清液试纸检查清液pH，用，用1M乙酸将乙酸将pH调至调至5.0，称为称为“粗级分粗级分I”。2. 热处理热处理 （1）预先将恒温水浴调到）预先将恒温水浴调到50，将盛有粗级分，将盛有粗级分I的离心管稳妥的离心管稳妥地放入水浴中，地放入水浴中，50下保温下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4，5000rpm，离心离心15min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力测定酶活力及蛋白质含量（称为及蛋白

23、质含量（称为“热级分热级分II”）。）。3. 乙醇沉淀乙醇沉淀 将热级分将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入入少量食盐），逐滴加入等体积等体积预冷至预冷至-20的的95%乙醇，同乙醇，同时轻轻搅拌，共需时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀分钟，以沉淀完全。于完全。于4，5000rpm，离心，离心15min，倾去上清，并风干，倾去上清，并风干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为存（称为“醇级分醇

24、级分”）。）。离子交换层析离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换层析技术是以离子交换纤维素离子交换纤维素或以离子交换葡聚或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为离子基团时，可换出阴离子，则称为阴阴离子交换剂。如二乙氨乙离子交换剂。如二乙氨乙基（基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素

25、。在纤维素上结合）纤维素。在纤维素上结合了了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素，含有带正电荷的阳离子纤维素OC6 H14NH+，它的反离子为阴离子（如它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。进行交换。 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳阳离子交换剂，离子交换剂，如羧甲基（如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素有负电荷的阴离子（纤维素OCH2COO-），其反离子为），其反离子为阳离子（如阳离子（如Na+等）等）,可与

26、带正电荷蛋白质阳离子进行交换。可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷负电荷。反之，溶。反之，溶液的液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷正电荷。溶液的溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。少。 在适当的盐浓度下，溶液的在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离值高

27、于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者

28、同时存在于一个层析过程中，都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的度，一种是改变洗脱液的pH值。值。pH值增高时，抑制蛋白质

29、阳值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。值。 离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换

30、剂颗粒的孔隙要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡

31、离子是型（即平衡离子是Na离子），阴离子），阴离子交换剂为离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是碱是NaOH或再加一定的或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为，这样处理后阳离子交换剂为Na型，型，阴离子交换剂为阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸，浸泡时间一般泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间。处理时应注意酸碱浓度不

32、宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。柱上操作柱上操作交换剂装柱最简单的交换层析柱可用交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管碱式滴定管代替。处理代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 上样向层析柱内倾入样品液上样向层析柱内倾入样品

33、液 洗脱与收集洗脱与收集 不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。离子交换柱层析纯化蔗糖酶离子交换柱层析纯化蔗糖酶 操作步骤 1.离子交换剂的处理： 称取1.5克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加入0.5M NaOH溶液（约50ml），轻

34、轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 M HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 M NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。（因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按“碱盐”的顺序洗即可（0.5 M NaOH,1 M NaCl 溶液处理），然后水洗至中性。最后保存在20%的酒精溶液中。2.装柱与平衡装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-

35、HCl 缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。（一般洗相同或接近时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）个柱体积）3.上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30ml含0.2MNaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml量杯，一个装30ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入30ml低

36、离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用用5ml 0.02M pH7.3的的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级缓冲液充分溶解醇级分分，若溶液混浊，则用小试管，若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。离心除去不溶物。取取1.5ml上清液（即醇级分上清液（即醇级分样品，留待下一个实验测酶活力及样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的蛋白含量），将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管动柱床，

37、注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到降到0.1以下，夹住层以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子的低离子强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分

38、，也可将所配制的剩余液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速3.0ml/10min。 测定每管洗脱液的测定每管洗脱液的A280光吸收值，合并活性最高的光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出总体积，此即管，量出总体积，此即“柱级分柱级分IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。来的活性峰。各级分蛋白质含量的测定各级分

39、蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验“蛋白质含量的测定法” 。各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 1050倍 热级分II： 1050倍 醇级分III： 1050倍 柱级分IV： 不稀释 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定标准蛋白质浓度：1mg/ml蔗糖酶各级分活性的测定蔗糖酶各级分活性的测定 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelsons试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂使用费林试剂法，法，以后测米氏常数以后测米氏常数Km和最大