GB∕T 40138-2021 南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

CCSB16

中华人民共和国国家标准

GB/T40138—2021

南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofSouthernbeanmosaicvirus

2021-05-21发布

2021-12-01实施

GB/T40138—2021

本文件按照GB/T1.1—2020((标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、广州海关技术中心、福建省农业科学院果树研究所。本文件主要起草人：张永江、刘晗、冯黎霞、谢丽雪、向均。

南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

1范围

本文件规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。

本文件适用于豆科植物植株及种子中南方菜豆花叶病毒的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4南方菜豆花叶病毒分类信息

中文名：南方菜豆花叶病毒

学名:Southernbeanmosaicvirus

异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4;南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirus1；菜豆南方花叶病毒Beansouthernmosaicvirus

分类地位：类南方菜豆花叶病毒目(Sobelivirales)南方菜豆一品红花叶病毒科｛Solemoviridae)南方菜花叶病毒属kSobcmovirus^)

南方菜豆花叶病毒的其他信息见附录A。

5方法原理

南方菜豆花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据南方菜豆花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DoubleAntibodySandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssay,DAS-ELISA)；依据南方菜豆花叶病毒的基因组特征建立反转录重组酶聚合酶扩增技术(ReverseTranscriptionRecombinasePolymeraseAmplification,RT-RPA)和荧光RTPCR检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有南方菜豆花叶病毒。

6试剂、仪器设备及用具

6.1试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。

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DAS-ELISA试剂应符合附录B中的B.l;

RT-RPA试剂应符合附录C中的C.1；

荧光RT-PCR试剂应符合附录D中的D.1。

6.2仪器设备

电子天平：感量0.001go

高速冷冻离心机:最大转速15000r/min。

微型瞬时离心机：最大转速7000r/min。

普通冰箱：4°C。

超低温冰箱：一80°C。

制冰机：每日制冰能力为110kg。

旋涡振荡器：最大转速为2800r/min。

磁力搅拌器:搅拌容量50mL〜2000mL。

高压灭菌锅：最大压力为0.235MPa,可调控温度范围为105°C-135°C。pH计：量程pH0.00〜14.00,精度±0.01pH。

紫外可见分光光度计:波长范围为220nm~750nm，波长精度为1nm，分辨率为3nm。金属浴：温度范围4°C〜150°C，控温精度±0.3°C。

荧光PCR仪：温度范围4°C-100°C，温度均一性±0.4°C。

微波炉：烧烤型。

电泳仪：输出电压5V〜600V，输出电流2mA〜200mA。

凝胶成像分析仪:光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、机载头像捕捉软件、图像分析软件。

洗板机：清洗容量50ptL~2000ptL。

酶标仪：光源波长：250nm〜750nm，温度范围4°C〜99°C。

6.3用具

酶联板。

PCR管。

可调移液器（2.5卜L，10卜L，20mI-100mL，200/^L,l000卜L）。

可调移液器头。

1.5mL离心管。

研钵、微型磨杵等。

7样品制备

7.1植株制样

待测样品为植株小苗时，挑选有疑似症状的部位取样，症状描述信息见附录A;未表现症状的植株分组（10株为1组）编号.将采集的每组样品分成3份，作为待检样品。

7.2种子样品直接制样

待检测样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小或有黑斑的种子；未表现症状种子分组（10粒为1组）编号，研磨成粉末，分成3份；在粉末中加人样品抽提缓冲液（B.1.5）,充分浸泡后离心取上清液作为待检样品。

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7.3种子样品种植制样

将种子播种于灭菌土中，待长出3片〜4片真叶后进行检测，取样制样同7.10

8检测鉴定

8.1DAS-ELISA测定

把制备的样品上清液加人已包被南方菜豆花叶病毒抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染南方菜豆花叶病毒的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品相一致。

具体操作按照附录B规定的方法进行。

8.2RT-RPA检测

RT-RPA检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddH2O）作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA后进行RT-RPA检测.具体操作按照附录C规定的方法进行。

8.3荧光RT-PCR检测

荧光RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddH2O）作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA后进行荧光RT-PCR检测，具体操作按照附录D规定的方法进行。

9结果判定

DAS-ELISA、RT-RPA和荧光RT-PCR中三种方法中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带南方菜豆花叶病毒。

10结果记录与样品保存

10.1结果记录

记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶联反应数值;RT-RPA检测应有电泳图片；荧光RT-PCR检测应有扩增曲线图。

10.2样品保存

阳性样品直接放于一80°C冰箱或冷冻干燥后放于一80°C冰箱，至少保存1年。保存的样品要做好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，应经灭活处理。

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附录A

（资料性）

南方菜豆花叶病毒其他信息

A.1寄主范围

寄主范围窄。除千日红｛Gomphrenaglobosa）外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆QPhaseolusvulgaris）、紅豆（Vignaunguiculata）S（Vzgwamungo）、绿豆（Vignaradiata、、棉豆（Phaseoluslunatus）和大豆（Glycinemax、等。

A.2地理分布

中国、印度、伊朗、巴基斯坦、贝宁、科特迪瓦、加纳、摩洛哥、美国、尼日利亚、塞内加尔、多哥、墨西哥、哥斯达黎加、尼加拉瓜、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉、法国、荷兰、西班牙等地。

A.3症状

菜豆（Phaseolusvulgaris^B株系和M株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些不能系统侵染。菜豆上的系统侵染根据寄主的不同变种，其症状有轻重。轻者引起微弱花叶，重者造成严重花叶甚至新叶畸变。G株系通常诱发无症状表现的系统侵染（见图A.1）。

大豆｛Glycinemax'）:许多株系可引起较弱的系统斑驳。

棉豆（Phaseoluslunatus｝^株系诱发产生小坏死斑。其他株系不敏感。

绿豆（Vignaradiata、:株系G引起局部小坏死斑，有些分离物引起系统花叶。

豆工豆（Vignaunguiculata）:株系G在某些过敏品种引起局部枯斑。系统症状表现为明脉、花叶和畸叶。

图A.1南方菜豆花叶病毒侵染菜豆（左）和大豆（右）引起的症状

A.4传播途径

病毒可由叶甲传播；菜豆种传率为1%〜5%，虹豆种传率为5%~40%；实验中易于机械接种传播。A.5粒体形态

病毒粒子为等轴对称的二十面体（T=3）.无包膜，直径约为30nm，有180个蛋白亚基。

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A.6抗原特性

南方菜豆花叶病毒抗原性强，容易制备高滴度的特异性抗体。

A.7基因组

基因组为ssRNA,全长约4136nt，编码4个蛋白，分别编码21kDa蛋白、105kDa蛋白(推测为聚合酶)、18kDa蛋白和30kDa蛋白。病毒RNA的3'端既无Poly(A)也无类似tRNA结构，其5'端有一个VPg，可能是侵染所必需的。

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附录B

(规范性)

双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

B.1试剂

B.1.1包被抗体

特异性的南方菜豆花叶病毒抗体;宜使用商品化试剂盒抗体;4°C保存不超过1年；抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释。

B.1.2酶标抗体

碱性磷酸酯酶标记的南方菜豆花叶病毒抗体。

B.1.3底物

对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。

B.1.4 1xPBST缓冲液(pH7.4)

氯化钠(NaCl)

磷酸二氢钾(KH2PO4)

磷酸氢二钠(Na2HPO4)

氯化钾(KC1)

吐温-20(Tween-20)

叠氮钠(NaN3)

8.0g

0.2g

1.15g

0.2g

0.5mL

0.2g

溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL，4°C储存。

B.1.5样品抽提缓冲液(pH7.4)

亚硫酸钠(Na2SO3)

聚乙烯基毗咯烷酮(PVP.MW24000-40000)

1.3g

20.0g

溶于900mL的1XPBST缓冲液中，并定容至1000mL,4°C储存。B.1.6包被缓冲液(pH9.6)

碳酸钠(Na2CO3)

碳酸氢钠(NaHCOs)

叠氮钠(NaN3)

1.59g

2.93g

0.2g

溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL,4°C储存。'.1.7酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)

牛血清白蛋白(BSA)

聚乙烯基毗咯烷酮(PVP,MW24000-40000)

2.0g

20.0g

溶于1000mLIXPBST缓冲液中，4°C储存。

6

B.1.8底物缓冲液（pH9.8）

97mL

0.1g

0.2g

二乙醇胺

氯化镁（MgCl2）

叠氮钠（NaN3）

溶于800mL灭菌双蒸水，用浓盐酸（HC1）调pH至9.8,定容至1000mL，4°C储存。

B.2试验步骤

B.2.1包被抗体

按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100 酶联板加盖或用保鲜膜

包好，37°C孵育2h。清空孔中溶液，用1XPBST缓冲液加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。

B.2.2样品制备与加样

按照1g待测样品，5mL〜10mL抽提缓冲液的比例，将待测样品与抽提缓冲液混合，在研钵中研磨；3000r/min离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按100f/L/孔分别加人制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照；酶联板加盖或用保鲜膜包好，4°C孵育过夜。酶联板用水彻底冲洗，再用1XPBST缓冲液洗涤3次，每次3mm。

B.2.3加酶标抗体

按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人酶联板中，100ML/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37°C孵育4h。酶联板用水彻底冲洗，再用1XPBST缓冲液洗涤3次，每次3min。

B.2.4加底物

将底物对硝基苯磷酸二钠（pNPP）加入底物缓冲液中，使终浓度为1mg/mL（现配现用）,100ML/孔加人酶联板中，室温避光孵育。

B.2.5读数

在不同的时间内如30min、60min、90min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。

B.3结果判定

B.3.1质量控制要求

对照孔的OD«5值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD4M值＜0.15,当阴性对照孔的ODW5值＜0.05时，按0.05计算；阳性对照OD4f,5值/阴性对照OD4（）5值〉5;同一样品的重复性基本一致。

B.3.2结果判定

在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下：样品（）134。5值/阴性对照（）认。5值〉2,判为阳性；样品0134。5值/阴性对照OD4Q5值为2时，判为可疑样品，需重做一次或用RT-RPA或荧光RT-PCR验证；样品01）4。5值/阴性对照0认。5值＜2,判为阴性。

若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判断。

附录C

(规范性)

RT-RPA检测

C.1试剂

C.1.1核酸提取及扩增试剂

核酸提取试剂为Tnzol或合格的RNA提取试剂盒。

RT-RPA扩增试剂盒为TwistAmpBasicRTKitso

C.1.2电泳缓冲液TAEC50X)

三羟甲基氨基甲烷(Tris)

冰乙酸(C2H4O2)

乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA•2H2O)

242g

57.1mL

37.2g

灭菌双蒸水定容至1000mL,用时稀释至1XTAE。

C.2检测步骤

C.2.1核酸提取

称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中，或将7.2制备的上清液100ptL移人1.5mL离心管中；加人1mL的Trizol试剂，剧烈震荡3min;4°C12000r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中.加人0.5mL氯仿，猛烈震荡15s；4°C12000r/min离心15min；小心吸取上层无色水相到新离心管中；加人等体积异丙醇，混匀；室温静置10min；4°C12(WOr/min离心10min，弃上清；加人1mL75%的冷乙醇洗涤沉淀；4°C10000r/min离心10min,弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后溶于30ML双蒸水中；使用分光光度计检测RNA纯度,OD260/OD280应在1.8〜2.1之间，一20°C保存备用。

注：此处以0.1g样品为例进行核酸提取，实际检测吋如样品量有变化.加人的试剂可按比例调整；或者按照商品化RNA提取试剂盒进行操作。

C.2.2引物序列

正向引物F:5'-TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCC-3'；

反向引物R：5z-ACTGTCACACCTCCAGCCGTTCTAAGCGATGGT-3/。

扩增片段长度约169bp。

C.2.3RT-RPA扩増

向含有酶的反应管中分别加人2X反应缓冲液29.5ML，正向引物F及反向引物R(均为10fimol/L)各2mL，醋酸镁(280mmol/L)2.5j/L，双蒸水12ML,RNA模板2yL;轻轻吸打混匀，放置于40°C金属浴中反应40min。

注：本反应体系是针对RT-RPA扩增试剂盒TwistAmpBasicRTKits(TABASRT01Kit)给出的，给出这一商品化试剂盒信息是为了方便本文件使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同效果，则可使用等效产品。

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C.2.4产物检测

反应结束后向上述RT-RPA扩增产物中加入50mL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000r/min离心2min，取5//L上清液按比例与电泳上样缓冲液混匀，用DNAMarker作为分子量标记，在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA片段，并拍摄记录。

C.3结果判定

如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期169bp的片段，样品未出现预期大小的片段，判定样品为阴性。

如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期169bp的片段，样品出现预期大小的片段，判定样品为南方菜豆花叶病毒。可通过序列测定和BLAST分析对PCR产物进一步确认，确认为南方菜豆花叶病毒的序列相似性为＞95%。

附录D

（规范性）

荧光RT-PCR

D.1试剂

核酸提取试剂同C.1.1。

D.2引物探针

荧光RT-PCR所用引物探针如表D.1。

表D.1引物探针序列

引物探针名称

引物探针序列（5'-3'）

FP

TTCCAATATGATATGGCTGACAC

FP1

TGACTCATTGGCCTATATTGGAA-P

RP

CCAGAGGATCCAGACCAGAC

RP1

TGACTAGAGAAGTCCTCTGG-P

FAM

FAM-CGTTAACCAGTTATCCAACCTTAGAGG-BHQ1

注：引物序列3'端的“P”表示以磷酸盐封闭引物3'端。

D.3核酸提取

方法同C.2.1。

D.4荧光RT-PCR反应

荧光RT-PCR反应体系及反