生物化学教学课件：第14章 DNA的生物合成

1、目目 录录第三篇遗传信息的传递目录目录目录目录蛋白质蛋白质DNARNAFrancis Crick (1916-2004 )DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis (Replication) 第第 十四十四 章章1. DNA复制（复制（DNADNA）2. 逆转录逆转录 ( RNADNA)复制复制( (replication)以母链以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。DNADNA复制的基本特征复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节目录目录半保留复制半保留复制semi-conservative repli

2、cation半不连续复制半不连续复制semi-discontinuous replication双向复制双向复制bidirectional replication复制的基本特征复制的基本特征 semi-conservative replication半保留复制的概念半保留复制的概念含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普通培养于普通培养液培养液(14N) 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。15N-DNA14N-DNA实验证据实验证据（同位素（同位素标记技术、密度梯度离心）标记技术、密度梯度离心）1958

3、年年Matthew Messelson和和Franklin Stahl遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。半保留复制的意义半保留复制的意义 按按半保留复制方式，子代半保留复制方式，子代DNA与与亲代亲代DNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即，即 子代子代保留了亲代的全部遗保留了亲代的全部遗传信息传信息，体现了遗传的，体现了遗传的保守性保守性 。起点起点起点原核生物DNA的双向复制原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉

4、，称为复制叉，称为双向复制双向复制。 二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个方向延伸53oriorioriori5355335533复制子复制子已完成复制的复制子已完成复制的复制子复复制制进进程程目录目录3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)3 5 三、三、DNA复制反应呈半不连续特征复制反应呈半不连续特征子链沿母链模板复制，只能从子链沿母链模板复制，只能从5 5向向3 3延伸。延伸。同一个同一个上只能有一个解链方向。上只能有一个解链方向。半不延续复制半不延续复制顺着解链方向生成的

5、子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链（领头链（leading strand）。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链（随从链（lagging strand）。复制中的不连续片。复制中的不连续片段称为段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性半不连续性(semi-discontinuou

6、s Replication)。 DNA复制的酶学和拓朴学变化复制的酶学和拓朴学变化The Enzymology and Topology of DNA Replication第二节第二节参与参与DNA复制的物质复制的物质参与参与DNA复复制的物质制的物质dNTPDNA-pol解成单链的解成单链的DNA母链母链与模板互补的与模板互补的RNA片段片段底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶简写简写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链

7、母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端末端使使dNTP可以依可以依次聚合次聚合解螺旋酶解螺旋酶引物酶引物酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白DNA连接酶等连接酶等复制的基本化学反应复制的基本化学反应特点：特点：需要需要引物引物和和模板模板； 新链的延长新链的延长5 3 方向方向PPiHOP PPG5 端端3 端端CGA一、一、DNA聚合酶催化脱聚合酶催化脱氧核苷酸之间聚合氧核苷酸之间聚合全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase ) (DNA-directed DNA polymerase)缩写：缩写：DNA-pol

8、 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶聚合酶1959 年获诺贝尔生理学或医学奖年获诺贝尔生理学或医学奖 奥乔亚奥乔亚 科恩伯格科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg（一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶目目 录录个核心酶个核心酶1个个 -复合物（复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚种亚基）基）1对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动的的DNA夹子）夹子）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：目目 录录 亚基亚基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有

9、具有35 外切酶活性（复制外切酶活性（复制保真性所必需）保真性所必需） 亚基可增强亚基可增强其活性其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用核心酶由核心酶由 、 和和 亚基组成：亚基组成：两侧的两侧的 亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳DNADNA模板链，并使酶模板链，并使酶沿模板滑动的作用沿模板滑动的作用目目 录录2个个 -亚基亚基分别和分别和1个核心酶相互作用，其个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在柔性连接区可以确保在复制叉复制叉1个全酶分子的个全酶分子的2个核心酶能够个核心酶能够相对独立相对独立运动运动，分别负责合成前分别负责合成前导链和后随链导链和后随链。功能：功能：有促进全酶组装至模板上

10、有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用及增强核心酶活性的作用 -复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成： 、 、 、 、 、 目录目录小片段小片段大片段大片段/Klenow 片段片段 N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进，进行分子生物学研究中常用的工具酶。行分子生物学研究中常用的工具酶。 NC大片段（大片段（Klenow片段）片段） DNA-pol （109kD） DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高对模板的特异性不高，即

11、使在已发生，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的损伤的应急状态修复应急状态修复。真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较聚合酶的比较 E.Coli真核细胞真核细胞 功能功能填补复制中的填补复制中的DNA空隙，空隙，DNA修复和修复和重组重组复制中的校对，复制中的校对，DNA修复修复 DNA修复修复 线粒体线粒体DNA合成合成 错配修复错配修复 引物酶引物酶 前导链和后随链合成，错配修复前导链和后随链合成，错配修复目录目录2. 酶在复制延长时酶在复制延长时对碱基的选择功能对碱基的选择功

12、能1. 遵守严格的遵守严格的碱基配对规律碱基配对规律3.复制出错时酶的复制出错时酶的及时校读功能及时校读功能DNA复制的复制的保真性保真性至少要依赖至少要依赖三种机制三种机制 二、二、DNA聚合酶的碱基选择和聚合酶的碱基选择和 校对功能实现复制的保真性校对功能实现复制的保真性三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把把DNA解成单链后，它才能起模板作用。解成单链后，它才能起模板作用。理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋

13、白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态利用利用ATP供能，在复制叉前解开一小段供能，在复制叉前解开一小段DNA1.解螺旋酶解螺旋酶 (helicase) ：3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶 该酶以该酶以DNA为模板

14、，为模板，2.2.引物酶( (primerase) )3 5 3 5 3.单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB) 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白对单链对单链DNA有高亲和力，能特有高亲和力，能特异地结合到分开的单链异地结合到分开的单链DNA上。上。 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整解链过程中，解链过程中，在在解开的两条单链解开的两条单链DNA分子的分子的前前方方会出现过度会出现过度拧紧拧紧、打结打结、缠绕缠绕和和连环连环等现象。等现象。（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态超螺旋状态拓扑异构酶的作用：拓扑异构酶的

15、作用：拓拓 扑扑 异异 构构 酶酶 对螺旋的作用对螺旋的作用松弛松弛 克服扭结克服扭结 断端沿螺旋轴松断端沿螺旋轴松解的方向移动解的方向移动断端沿螺旋轴松断端沿螺旋轴松解的方向移动解的方向移动有有ATP 进入负超进入负超螺旋螺旋 解螺旋酶和拓扑异构酶的联合作用：解螺旋酶和拓扑异构酶的联合作用：DNA双链解成单链。双链解成单链。555四四.DNA.DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接酶连接复制中产生的单链缺口DNA连接酶连接酶原核生物原核生物DNADNA复制过程复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第三节第三节需要解决两个问题：需要

16、解决两个问题：1. DNA解开成单链，解开成单链，提供模板提供模板。2. 形成引发体，合成引物，形成引发体，合成引物，提供提供3 -OH末端末端。一、复制的起始一、复制的起始 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 （一）（一）

17、DNA解链解链目录目录 Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。解解螺螺旋旋酶酶目录目录3 5 3 5 引物引物3 HO5引物引物酶酶n引物引物是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。n在领头链（模板）上，在领头链（模板）上，引物酶（引物酶（DnaG）与）与解螺旋酶（解螺旋酶（DnaB）结合成复合物）结合成复合物解链及解链及引物合成引物合

18、成引物引物酶酶 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol III复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 二、二、DNA链的延长链的延长复制的延长复制的延长复复制制过过程程简简图图5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP AMP+PPi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接

19、3 三、复制的终止三、复制的终止 冈崎片段的连接冈崎片段的连接哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM第四节第四节真核生物真核生物DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes 真核生物每个染色体有多个起始点，是真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制多复制子复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。激活而不是同步启动。一、真核生物复制的起始与原核生物基本相似一、真核生物复制的起始与原核生物基本相似 复制的起始需要复制的起始需要DNA-po

20、l（引物酶活性）（引物酶活性）和和DNA-pol（解螺旋酶活性）（解螺旋酶活性）参与。参与。 还需拓扑异构酶和复制因子还需拓扑异构酶和复制因子(RF)。 二、真核生物复制的延长发生二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换 前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续合成能力持续合成能力。 DNA聚合酶聚合酶 / 转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC 。DNA聚合酶聚合酶 / 转换转换3553领头链领头链随从链随从链引物引物核小体

21、核小体三、真核生物三、真核生物DNADNA合成后立即组装成核小体合成后立即组装成核小体5353亲代亲代DNA真核生物真核生物DNA复制与核小体组装同步复制与核小体组装同步进行，复制完成后随即组装成染色体进行，复制完成后随即组装成染色体3535355353535353真核生物真核生物DNADNA复制完成后，子链末端留下复制完成后，子链末端留下空隙空隙，母链成单链，母链成单链四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题 1、端粒、端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的

22、稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由富含由富含TG的重复序列组成的重复序列组成; 人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3。TTTTGGGGTTTTGGGG2 2、端粒酶、端粒酶(telomerase) 特点：特点： 1. 由由RNA和蛋白质构成的复合物和蛋白质构成的复合物 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为为 模板逆转录合成端粒模板逆转录合成端粒DNA 功能：功能： 合成端粒合成端粒DNA，维持端粒的长度，维持端粒的长度5 端粒酶端粒酶ACUAAACCCA AAACAAACCGAC35端粒酶的端粒酶的RNAA

23、CUAAACCCA AAACAAACCGAC353GTTTTGGGTTTTGG3OH端粒端粒DNA末端末端TGGTTTG3OH1 1、端粒酶靠、端粒酶靠AnCnAnCn与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合内在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸。TGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGT

24、TTGGGGGGGGGTTTTGGTTTT4 4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol DNA-Pol 。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol端粒酶的催化延长作用端粒酶的催化延长作用 爬行模型爬行模型逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第五节第五节 David BaltimoreRenato DulbeccoHowa