抗原抗体反应

1、2021/3/171临床免疫学检测技术及应用临床免疫学检测技术及应用 2008-3-312008-3-312021/3/172Immunologic technique/applianceImmunologic technique/appliance Classical antigen andClassical antigen and antibody reaction antibody reaction ( (抗原抗体反应抗原抗体反应) )lImmunoassay (IA)Immunoassay (IA) ( (免疫测定免疫测定) ) Immunolabeling technique Imm

2、unolabeling technique ( (标记免疫技术标记免疫技术) )2021/3/173 一、一、Classical antigen Classical antigen and antibody reaction and antibody reaction2021/3/174Antigen and Antibody reactionAntigen and Antibody reactionl Ag + Ab Ag-Ab + Ag/AbAg + Ab Ag-Ab + Ag/Ab In vivo ( In vivo (不同免疫应答的效应作用不同免疫应答的效应作用) ) In vitro

3、 In vitro （抗原抗体结合反应（抗原抗体结合反应, ,多样性）多样性）2021/3/175l抗原抗原/ /抗体反应的抗体反应的特点特点: : 特异性（特异性（specificspecific） 最适比（最适比（optimal ratiooptimal ratio） 可逆性（可逆性（reversiblereversible） 亲和性（亲和性（afinityafinity）和亲和力（）和亲和力（avidityavidity）2021/3/176l抗原抗原/ /抗体反应分抗体反应分两阶段两阶段l（一）抗原（一）抗原/ /抗体发生特异性结合抗体发生特异性结合 1 1、亲水胶体转变为疏水胶体（水

4、化层）、亲水胶体转变为疏水胶体（水化层） 2 2、抗原抗体的结合力（静电引力、范登华引力、氢键、抗原抗体的结合力（静电引力、范登华引力、氢键 结合力、疏水结合力等）结合力、疏水结合力等）l（二）抗原（二）抗原/ /抗体结合的可见反应抗体结合的可见反应 1 1、凝集、凝集 2 2、沉淀、沉淀 3 3、溶细胞、溶细胞 4 4、等等、等等 2021/3/177In vitroIn vitro（classicalclassical）lPrecipitation ReactionPrecipitation Reaction （沉淀反应）（沉淀反应）lAgglutination ReactionAgglu

5、tination Reaction （凝集反应）（凝集反应）lAntigen and Antibody Reaction Antigen and Antibody Reaction Involved by ComplementInvolved by Complement （补体介导的抗原抗体反应）（补体介导的抗原抗体反应）lEt alEt al2021/3/178Precipitation ReactionPrecipitation ReactionlImmunodifusionImmunodifusion（免疫扩散）（免疫扩散）lImmunoturbidimetryImmunoturbidi

6、metry（免疫浊度）（免疫浊度）lImmunoeletrophoresisImmunoeletrophoresis（免疫电泳）（免疫电泳）lEt al(Et al(环状）环状） （絮状）（絮状）2021/3/1792021/3/1710沉淀反应的类型归纳沉淀反应的类型归纳 环状沉淀反应环状沉淀反应 液相（液体）液相（液体） 絮状沉淀反应絮状沉淀反应 免疫浊度测定免疫浊度测定l沉淀反应沉淀反应 免疫扩散免疫扩散 固相（凝胶）固相（凝胶） 免疫电泳免疫电泳 2021/3/1711免疫浊度免疫浊度(turbidimetry)(turbidimetry)测定测定: :l含义含义:是将是将光学测量仪光

7、学测量仪与与自动分析自动分析检测系统检测系统结合结合,应用于沉淀反应试验。应用于沉淀反应试验。l原理原理:抗原抗体在检测反应液中会形成抗原抗原抗体在检测反应液中会形成抗原抗体抗体复合物复合物,使得反应液出现使得反应液出现浊度浊度。当反应。当反应液中保持抗体过剩液中保持抗体过剩,形成的复合物随样本中形成的复合物随样本中抗原的量增加而增多抗原的量增加而增多,反应液的浊度亦随之反应液的浊度亦随之增高。与系列标准品对照增高。与系列标准品对照(标准曲线标准曲线),可计可计算样本中被测抗原的浓度。算样本中被测抗原的浓度。2021/3/1712 透射免疫比浊（透射免疫比浊（turbidimetryturbi

8、dimetry）l免疫比浊免疫比浊测定仪测定仪 散射免疫比浊（散射免疫比浊（nephelometrynephelometry） 包括包括 终点终点 速率速率2021/3/1713Agglutination ReactionAgglutination Reaction l例: 人类人类ABOABO血型血型检测检测( (玻片玻片) ) 肥达肥达(Widal)(Widal)反应反应 directdirect 类风湿因子测定类风湿因子测定( (乳胶乳胶) indirect) indirect 包括包括- -正向正向 反向反向 抗红细胞不完全抗体抗红细胞不完全抗体(Coobs)(Coobs) 2021/

9、3/1714补体介导的抗原抗体反应补体介导的抗原抗体反应(complement)(complement)l例例:CHCH5050（complement hemolysis 50%)(complement hemolysis 50%)(测补体）测补体）脂质体免疫法检测补体（测补体）脂质体免疫法检测补体（测补体）微量细胞毒试验（微量细胞毒试验（complement dependent complement dependent cytotoxicity cytotoxicity; ;CDCCDC）（交叉配型）（交叉配型）特定蛋白检测仪及配套试剂（补体单成分）特定蛋白检测仪及配套试剂（补体单成分）20

10、21/3/1715二、二、Immunolabeling TechniqueImmunolabeling Technique2021/3/1716Immunolabeling TechniqueImmunolabeling Techniquel原理原理: :于抗原或抗体上标记于抗原或抗体上标记可以微量检测的可以微量检测的标记物标记物（荧光素、酶或同位素等）（荧光素、酶或同位素等）, ,待特异待特异性抗原抗体反应后性抗原抗体反应后, ,所测的不必是抗原所测的不必是抗原- -抗抗体复合物本身体复合物本身, ,而而测定复合物中的标记物测定复合物中的标记物, ,并可通过标记物的并可通过标记物的放大作用放

11、大作用, ,进一步提高其进一步提高其检测的检测的敏感敏感度。度。2021/3/1717Immunolabeling TechniqueImmunolabeling TechniquelEnzyme linked immunosorbent assayEnzyme linked immunosorbent assay （ELISAELISA）lFluorescence immunoassayFluorescence immunoassay（FIAFIA）lRadioimmunoassayRadioimmunoassay（RIARIA）lLuminescence immune-techniqueL

12、uminescence immune-techniquelSolid phase membrane-based Solid phase membrane-based immunoassayimmunoassaylBiotin-avidin systemBiotin-avidin system（BASBAS）2021/3/1718酶免疫技术酶免疫技术/ELISA/ELISAl酶免疫技术酶免疫技术 是以酶标记抗原或抗体作为是以酶标记抗原或抗体作为主要试剂的免疫测定方法。主要试剂的免疫测定方法。lELISA ELISA 是以酶作为标记指示物、以抗原是以酶作为标记指示物、以抗原抗体反应为基础的抗体反应

13、为基础的固相固相吸附测定。吸附测定。2021/3/1719酶免疫技术酶免疫技术分类分类l（一）酶免疫组织化学测定技术（一）酶免疫组织化学测定技术l（二）酶免疫测定技术（二）酶免疫测定技术 Ab Ab * *Ag AbAg Ab* *Ag Ag AbAb* * Ab Ab Ag Ag * * AbAg AbAg * * AgAg* * （1 1）Homogenous Homogenous （均相测定）（均相测定） （2 2）HetergenousHetergenous（异相测定）（异相测定） Solid phase Solid phase （固相）（固相）2021/3/1720ELISAELIS

14、A: :lELISA ELISA 是以酶作为是以酶作为标记指示物、以抗原标记指示物、以抗原抗体反应为基础的固抗体反应为基础的固相吸附测定。相吸附测定。2021/3/1721 抗原抗原/ /抗体的固相化抗体的固相化 （coatingcoating, ,包被）包被） （immunosorbentimmunosorbent） ( (蛋白分子表面效应蛋白分子表面效应) )操作操作: :（例）（例）Ag/Ab in Ag/Ab in pH 9.6pH 9.6 carbonate buffer carbonate buffer Incubated at Incubated at 44 for overni

15、ght for overnight2021/3/1722 表面效应表面效应:l蛋白质分子在吸附（包被）过程蛋白质分子在吸附（包被）过程,为了克服为了克服与固相载体之间的排斥力与固相载体之间的排斥力,需要重新分布其需要重新分布其表面的功能性基团表面的功能性基团,使疏水性基团充分暴露使疏水性基团充分暴露,然后然后,局部接触区域的偶极分子脱氢局部接触区域的偶极分子脱氢,再通过再通过范德瓦尔引力将其固相于范德瓦尔引力将其固相于载体表面。整个载体表面。整个过程谓过程谓coatingcoating。l影响影响: :抗原抗体的构象和功能抗原抗体的构象和功能; ;抗原抗原- -抗体结抗体结合反应的动力学过程。

16、合反应的动力学过程。2021/3/1723 区别区别:l （1）非共价吸附）非共价吸附l抗体或蛋白通过疏水性相互作用而附着抗体或蛋白通过疏水性相互作用而附着l （2）共价吸附）共价吸附l借助固相上的借助固相上的活性基团活性基团,通过化学通过化学交联交联剂与剂与抗原抗原/抗体分子上相应抗体分子上相应活性基团活性基团反应形成共反应形成共价键价键,固着固着 2021/3/1724固相载体固相载体材料要求材料要求: :1 1、结合容量、结合容量2 2、结合能力、结合能力3 3、结合性质、结合性质4 4、性价比、性价比种类种类: :1 1、聚苯乙烯聚苯乙烯2 2、聚氯乙烯、聚氯乙烯3 3、硝酸纤维素膜、

17、硝酸纤维素膜4 4、尼龙膜、尼龙膜5 5、磁性微粒、磁性微粒孔间差异孔间差异（10%10%） 2021/3/1725对策对策l一、一、l用一定浓度的人用一定浓度的人IgGIgG（10ng/ml10ng/ml）l适当稀释度的酶标抗人适当稀释度的酶标抗人IgGIgGl控制反应各条件控制反应各条件l计算各孔读值的平均值并要求每孔的读值与其平均值间的计算各孔读值的平均值并要求每孔的读值与其平均值间的差异小于差异小于10%10%。l二、二、l选择已知阳性与阴性标本选择已知阳性与阴性标本, ,作系列稀释作系列稀释l在不同固相载体上按预定的在不同固相载体上按预定的ELISAELISA法进行操作测定法进行操作

18、测定l评判的标准评判的标准: :阳性结果与阴性结果阳性结果与阴性结果差别最大差别最大的好的好2021/3/1726BlockingBlocking（封闭）（封闭）lAg/AbAg/Ab被固相化后被固相化后, ,固相载体表面会留有少固相载体表面会留有少量未被吸附的位点（量未被吸附的位点（空空）, ,反应过程中加入反应过程中加入的待检标本或酶标抗体等可能与之吸附的待检标本或酶标抗体等可能与之吸附（非特异）（非特异）, ,导致其检测的本底偏高。为避导致其检测的本底偏高。为避免之免之, ,包被后再用包被后再用BSABSA或或小牛血清小牛血清包被一包被一次次 Blocking Blocking。2021

19、/3/1727用于酶免疫测定的抗原与抗体用于酶免疫测定的抗原与抗体l1 1、用途、用途: :包被与标记包被与标记l2 2、种类、种类: :抗原抗原 天然、重组、合成天然、重组、合成 抗体抗体 多克隆、单克隆多克隆、单克隆l3 3、要求、要求: :抗原抗原纯度纯度高、抗体高、抗体效价效价高、高、结合结合 力力高（对照孔）高（对照孔）l4 4、适宜工作浓度、适宜工作浓度2021/3/1728l以以Fmoc-Gly-WangFmoc-Gly-Wang树脂为树脂为载体载体, ,以以N-FmocN-Fmoc基团基团保护保护的的氨基酸为原料氨基酸为原料, ,以以HBTU/HoBtHBTU/HoBt作作为为

20、偶联偶联试剂试剂, ,从从C-NC-N端顺序依次偶联所需的端顺序依次偶联所需的氨基酸氨基酸, ,直至合成所需的各肽段。然后将肽直至合成所需的各肽段。然后将肽从树脂上裂解下来从树脂上裂解下来, ,洗涤洗涤, ,冻干得到短肽。冻干得到短肽。 2021/3/17292021/3/1730间接间接ELISAELISA法包被抗原工作浓度的选择法包被抗原工作浓度的选择 各类血清各类血清 包被抗原稀释度包被抗原稀释度 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1601:100 1:200 1:400 1:800 1:160 强阳性强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.421.20 1

21、.04 0.84 0.68 0.42 弱阳性弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.190.64 0.41 0.30 0.22 0.19 阴性阴性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.050.23 0.13 0.08 0.66 0.05 稀释液稀释液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.040.09 0.02 0.02 0.02 0.04 选择标准选择标准: :强阳性参考血清强阳性参考血清A A值为值为0.80.8左右左右, ,阴性参考血清阴性参考血清A A值值0.10.12021/3/1731酶免疫测定的酶结合物制备酶免疫测定的酶结合物制备l* *酶结合物（酶结合

22、物（conjugateconjugate）或称酶标抗体或或称酶标抗体或抗原。一般是通过化学交联抗原。一般是通过化学交联( (耦联耦联) )或免疫或免疫学反应而获得。学反应而获得。l适宜标记用适宜标记用酶酶的要求的要求: : 酶活性酶活性 具共价交联能力具共价交联能力 催化底物产有色信号并易于检测催化底物产有色信号并易于检测 自身稳定自身稳定, ,不易受干扰不易受干扰2021/3/1732免疫测定技术常用的酶及其免疫测定技术常用的酶及其底物底物(substrate(substrate) 酶酶 底物底物 显色反应显色反应 测定波长测定波长辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺 橘红色橘红色

23、 492492 四甲基联苯胺四甲基联苯胺 黄色黄色 460460 氨基水杨酸氨基水杨酸 棕色棕色 449449 邻联苯甲胺邻联苯甲胺 兰色兰色 425425 2,2- 2,2-连胺基连胺基-2-2（3-3-乙基乙基- - 并噻唑啉磺酸并噻唑啉磺酸-6-6）铵盐）铵盐 蓝绿色蓝绿色 642642碱性磷酸酶碱性磷酸酶 4-4-硝基酚磷酸盐（硝基酚磷酸盐（PNPPNP） 黄色黄色 400400 萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 红色红色 500500葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 黄色黄色 405,420405,420 葡萄糖

24、葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 深蓝色深蓝色 405,420405,420D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷（甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG4MuG） 荧光荧光 360,450360,450 硝基酚半乳糖苷（硝基酚半乳糖苷（ONPGONPG） 黄色黄色 4204202021/3/1733ConjugateConjugate的制备的制备l1 1、戊二醛交联法、戊二醛交联法（一步（一步/ /二步）二步） 酶酶-NH-NH2 2 O=C-H O=C-H 酶酶- -N=CHN=CH | | | | + + （CHCH2 2) )3 3 CHCH3 3 | | | | 抗体抗

25、体-NH-NH2 2 O=C-H O=C-H 抗体抗体-N=CH-N=CH 2 2、过碘酸钠法、过碘酸钠法 利用过碘酸钠将酶蛋白分子中与酶活性无关的多糖分子的利用过碘酸钠将酶蛋白分子中与酶活性无关的多糖分子的羟基氧化羟基氧化成活泼的成活泼的醛基醛基 + + 抗体蛋白游离抗体蛋白游离氨基氨基形成形成 Schiffs Schiffs碱而交联碱而交联 2021/3/1734Homogenous Homogenous （均相测定）（均相测定） Ab Ab * *Ag AbAg Ab* *Ag Ag AbAb* * Ab Ab Ag Ag * * AbAg AbAg * * AgAg* * Ab Ab*

26、 *Ag Ag AbAb* * AbAg AbAg * * AgAg* * 不需分离不需分离, ,但但AbAb* */Ag/Ag* *酶需失活酶需失活例例: :enzyme-multiplied immunoassay tecniqueenzyme-multiplied immunoassay tecnique (EMIT, (EMIT,酶扩大免疫测定技术酶扩大免疫测定技术) ) clonedenzymedonorimmmunoassay (CEDIA) clonedenzymedonorimmmunoassay (CEDIA) ( (克隆酶供体免疫测定克隆酶供体免疫测定) ) 2021/3/

27、1735 EMIT EMIT测定测定: :检测对象检测对象: :半抗原半抗原试剂试剂: : 抗体抗体 酶标记半抗原酶标记半抗原 底物底物反应模式反应模式: :竞争法竞争法2021/3/1736CEDIACEDIA测定测定: :enzymeacceptorenzymeacceptor, ,EAEA（酶受体）（酶受体）enzymedonorenzymedonor, ,EDED（酶供体）（酶供体）EAEA、EDED游离无酶活性游离无酶活性检测对象检测对象: :药物、小药物、小分子物分子物试剂试剂: :抗体、抗体、EAEA ED ED标记抗原标记抗原 底物底物反应模式反应模式: :竞争法竞争法2021

28、/3/1737固相膜免疫吸附测定固相膜免疫吸附测定l固相载体固相载体: :硝酸纤维素微孔膜硝酸纤维素微孔膜l标记物选择标记物选择: :有色微粒子（胶体金）有色微粒子（胶体金）l反应形式反应形式: :穿流（渗滤）穿流（渗滤）l 横流（层析）横流（层析）l Western BlotWestern Blotl 重组免疫结合试验（重组免疫结合试验（RIBARIBA） l应用应用: :药物、激素、抗生素等药物、激素、抗生素等 2021/3/1738Fluorescence immunoassayFluorescence immunoassay（FIAFIA）l以荧光素为标记物并标记抗体以荧光素为标记物并

29、标记抗体/ /抗原抗原, ,当抗当抗原原- -抗体特异性结合抗体特异性结合, ,在荧光显微镜下可示在荧光显微镜下可示踪踪, ,实际工作中普遍使用。由于主要用荧光实际工作中普遍使用。由于主要用荧光素标记抗体去检测相应抗原（定位、定素标记抗体去检测相应抗原（定位、定量）量）, ,所以统称所以统称荧光抗体技术荧光抗体技术（fluorescent antibody techniquefluorescent antibody technique）l分类分类: :荧光免疫显微技术（流式）荧光免疫显微技术（流式） 荧光免疫测定荧光免疫测定 （非均相（非均相/ /均相）均相） 2021/3/1739l荧光（荧

30、光（fluorescencefluorescence）: : 某些物质在光的照射下某些物质在光的照射下, ,吸收光能进入激发态吸收光能进入激发态, ,当其从激发态返回原基态时当其从激发态返回原基态时, ,以电磁辐射形式放射以电磁辐射形式放射出所吸收的光能出所吸收的光能, ,称为光致发光。称为光致发光。 若用一短波长光照射某物质若用一短波长光照射某物质, ,该物质能发射较长该物质能发射较长波长的光波长的光, ,此种光被称谓荧光。此种光被称谓荧光。l荧光素（荧光素（ fluorchrome fluorchrome ）: : 是指一些具有光致荧光特性的染料物质。是指一些具有光致荧光特性的染料物质。l

31、荧光的荧光的淬灭淬灭现象现象: : 某些理化因素可使得荧光色素的辐射能力减弱或某些理化因素可使得荧光色素的辐射能力减弱或消失的现象。消失的现象。2021/3/1740常用的荧光素常用的荧光素l1 1、异硫氰基荧光黄（、异硫氰基荧光黄（FITCFITC） 纯品为纯品为黄色结晶粉末黄色结晶粉末, ,最大吸收光谱最大吸收光谱490490495mm495mm, ,最大发射光谱最大发射光谱520520530mm530mm, ,呈呈明亮黄绿色明亮黄绿色荧光。荧光。l2 2、四乙基罗丹明（、四乙基罗丹明（RB200RB200） 纯品为橘红色粉末纯品为橘红色粉末, ,最大吸收光谱最大吸收光谱570mm570m

32、m, ,最大发最大发射光谱射光谱595595600mm600mm, ,呈明亮橙色荧光。呈明亮橙色荧光。l3 3、四甲基异硫氰基罗丹明（、四甲基异硫氰基罗丹明（TRITCTRITC） 罗丹明的衍生物罗丹明的衍生物, ,纯品为紫红色粉末纯品为紫红色粉末, ,最大吸收最大吸收光谱光谱550mm550mm, ,最大发射光谱最大发射光谱620mm620mm, ,呈橙红荧光。呈橙红荧光。2021/3/1741常用的荧光抗体标记方法常用的荧光抗体标记方法l即荧光素与抗体的结合即荧光素与抗体的结合荧光素荧光素有活泼的化学基（偶氮基有活泼的化学基（偶氮基N=N） （异氰基（异氰基N=C=O） （异硫氰基（异硫氰

33、基N=C=S）抗体抗体蛋白有氨基酸的自由氨基蛋白有氨基酸的自由氨基方法方法:透析透析 搅拌搅拌结合物结合物 （荧光素（荧光素N-C-N-蛋白质）蛋白质） l l l H S H2021/3/1742荧光免疫测定荧光免疫测定 （非均相（非均相/ /均相）均相） l时间分辨荧光免疫测定（时间分辨荧光免疫测定（TR-FIATR-FIA）（非）（非）2021/3/17430 400 800 1000短寿荧光长寿荧光长寿荧光延缓时间计数时间荧光强度时间us时间分辨荧光免疫测定原理示意图2021/3/1744时间分辨荧光免疫测定（时间分辨荧光免疫测定（TR-FIATR-FIA）原理）原理l1 1、用荧光寿

34、命较长的稀土金属（、用荧光寿命较长的稀土金属（EuEu、TbTb等）作标等）作标记物记物, ,标记抗原或抗体。标记抗原或抗体。l2 2、利用时间分辨荧光分析仪、利用时间分辨荧光分析仪l3 3、延缓测量时间、延缓测量时间, ,以排除标本中的自发荧光。因以排除标本中的自发荧光。因为后者的荧光寿命很短。为后者的荧光寿命很短。l4 4、稀土金属的激发光波长与发射波长间距大、稀土金属的激发光波长与发射波长间距大（StokesStokes移位移位290nm/290nm/一般荧光一般荧光StokesStokes移位移位28nm28nm）l5 5、灵敏度高（、灵敏度高（0.20.21ng/ml1ng/ml）2

35、021/3/1745荧光免疫测定荧光免疫测定 （非均相（非均相/ /均相）均相） l荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定(FPIA)(FPIA)(均均) )2021/3/1746l当当待测抗原浓度高待测抗原浓度高时时,经竞争反应大部分经竞争反应大部分抗体被其抗体被其结合结合,而而荧光素标记的抗原多呈游离荧光素标记的抗原多呈游离的小分子状态。的小分子状态。由于其由于其分子小分子小,测量到的荧光测量到的荧光偏振光较低偏振光较低。反之。反之,待测抗原浓度低时待测抗原浓度低时,大部分荧光素标记抗原与抗体大部分荧光素标记抗原与抗体结合结合,形成形成大分子大分子的标记抗原抗体复合物的标记抗原抗体复合物,此时检

36、此时检测到的荧光测到的荧光偏振程度也较高。偏振程度也较高。荧光偏振免疫分析示意图2021/3/1747荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定(FPIA)(FPIA)原理原理 1 1、荧光物质在溶液中被单一平面的、荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光偏振光（波长（波长485nm485nm）照射后）照射后, ,可吸收光能进入激发态可吸收光能进入激发态; ;当其恢复至当其恢复至基态时释放能量的同时发射基态时释放能量的同时发射偏振荧光偏振荧光（波长（波长525nm525nm）。）。 2 2、偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速、偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度呈反比。（大分子度呈反比。（

37、大分子/ /慢慢- -强强, ,小分子小分子/ /快快- -弱弱）。）。 3 3、FPIAFPIA主要用于测定主要用于测定药物（小）药物（小）浓度。浓度。 4 4、当、当药物药物与与荧光标记药物荧光标记药物竞争一定量抗体竞争一定量抗体, ,结结果标本中果标本中药物药物高高, ,荧光标记药物荧光标记药物- -抗体形成低抗体形成低, ,据标据标准曲线计算准曲线计算药物药物含量。（呈反比）含量。（呈反比）2021/3/1748其他标记其他标记l1 1、放射性核素标记物、放射性核素标记物l2 2、发光标记物、发光标记物 chemiluminescence immunoassay,CLIAchemilu

38、minescence immunoassay,CLIA luminescence enzyme immunoassay,IEIA luminescence enzyme immunoassay,IEIA bioluminescence immunoassay,BLIA bioluminescence immunoassay,BLIAl3 3、金标记物金标记物l4 4、生物素、生物素- -亲和素系统（亲和素系统（BASBAS）2021/3/1749Immnogold labeling techniqueImmnogold labeling techniquel金标记免疫技术是以金标记免疫技术是以

39、胶体金胶体金标记物标记抗原或抗标记物标记抗原或抗体体,对样本中相应抗体或抗原进行检测。对样本中相应抗体或抗原进行检测。l胶体金胶体金 一般指金的水溶液一般指金的水溶液, ,又称金溶胶。又称金溶胶。 金颗粒直径在金颗粒直径在1 1100nm100nm之间。之间。 其对电解质敏感其对电解质敏感, ,水化层破坏颗粒凝聚水化层破坏颗粒凝聚 据颗粒大小据颗粒大小, ,其呈色性不同。其呈色性不同。 2021/3/1750 胶胶 体体 金（金（Colloidal GoldColloidal Gold） 151560 nm60 nm2021/3/1751胶体金的制备胶体金的制备l还原法还原法( (最常用的化学

40、方法最常用的化学方法) )l原理原理: :在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂, , 使使金离子金离子还原为还原为金原子金原子。在适当条件下。在适当条件下, , 还原的金原子凝聚成一定大小的还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒金颗粒, , 形成金溶胶。形成金溶胶。l常用的还原剂常用的还原剂: :柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白 磷、硼氢化钠等磷、硼氢化钠等 l柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大, ,1515150nm 150nm 2021/3/1752 烧制胶体金步骤烧制胶体金步骤:l取取预先处理预先处理过的三

41、角烧瓶过的三角烧瓶 加入沸石与适量双蒸水加入沸石与适量双蒸水220V220V、煮沸、煮沸弃去瓶内液体弃去瓶内液体, ,加入双蒸水加入双蒸水, ,再次再次煮沸煮沸沸腾状态下沸腾状态下加入适量柠檬酸三钠加入适量柠檬酸三钠15152020秒后秒后加入适量氯金酸加入适量氯金酸2min2min内内液体由液体由黑色黑色变为变为暗紫红色暗紫红色75V75V、微沸、微沸冷却后冷却后, ,520nm520nm下测下测ODOD值值ODOD值在值在1.01.01.11.1之间最佳之间最佳2021/3/1753注意事项注意事项: :1.玻璃器皿的清洁玻璃器皿的清洁 玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗清洁液浸泡清洁液浸泡24h

42、流水冲流水冲双蒸水双蒸水 反复洗涤反复洗涤晾干晾干2. 试剂配制试剂配制 应尽量使用分析纯试剂应尽量使用分析纯试剂 各种水溶液必须用双蒸水或三蒸水配制各种水溶液必须用双蒸水或三蒸水配制3. 影响胶体金颗粒大小的因素影响胶体金颗粒大小的因素 加入还原剂的速度与加入的量加入还原剂的速度与加入的量 搅拌是否均匀搅拌是否均匀 制备胶体金所用的烧瓶大小制备胶体金所用的烧瓶大小2021/3/1754 胶体金结合物（胶体金结合物（ConjugateConjugate） 2021/3/1755免疫胶体金制备免疫胶体金制备1)1)在胶体金溶液中加入在胶体金溶液中加入适合比例适合比例的抗体（或抗原）的抗体（或抗原

43、）2)2)加适量加适量碳酸钾碳酸钾, ,观察溶液颜色变化（观察溶液颜色变化（当胶体金与待当胶体金与待 标记的蛋白比例合适时标记的蛋白比例合适时, ,溶液颜色无变化溶液颜色无变化）。）。3)3)用高速离心机离心并弃去上清液用高速离心机离心并弃去上清液, ,加入清洗液再次加入清洗液再次 高速离心高速离心, ,弃去上清液弃去上清液, ,（注（注: :吸取上清液时不要吸取上清液时不要 吸走沉淀物质）。吸走沉淀物质）。4)4)余下的沉淀物质就是缀合后的胶体金余下的沉淀物质就是缀合后的胶体金, ,加恢复液用加恢复液用 10ml10ml玻璃针筒、滤器超滤到一定体积（即恢复浓玻璃针筒、滤器超滤到一定体积（即恢复浓 度）。度）。2021/3/1756胶体金标记免疫测定模式胶体金标记免疫测定模式l1 1、斑点金免疫、斑点金免疫渗滤渗滤试验试验 （dot immunogo