6.第六章 外源化学物的一般毒性作用

1、青大医学院公卫系 王树林12021-6-14青大医学院青大医学院公共卫生系公共卫生系王树林王树林青大医学院公卫系 王树林22021-6-14 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 急性毒性作用急性毒性作用 第三节第三节 局部毒性作用局部毒性作用 第四节第四节 短期、亚慢性和慢性毒性实验短期、亚慢性和慢性毒性实验青大医学院公卫系 王树林32021-6-14毒理学研究方法毒理学研究方法体外实验体外实验(in vitro)流行病学研究流行病学研究 (Epidemiological Study) 体内实验体内实验 (in vivo) 整体动物实验整体动物实验人体观察人体观察 离体器官组织： 心、肝、肺

2、、肾、脑 细胞原代细胞、细胞株、细胞系细胞器： 线粒体、微粒体等特殊毒性：致突变致畸 致癌 临床毒理学研究：中毒事故的处理或治疗 描述流行病学研究：提出病因假说 分析流行病学研究： 验证病因假说，明确因果关系基础毒性：急性亚急性亚慢性慢性 刺激性志愿者研究：低浓度、短时间 、可逆性 青大医学院公卫系 王树林42021-6-14 毒理学研究方法分类：毒理学研究方法分类： 一、按一、按染毒频率染毒频率分为：分为： 急性毒性实验：急性毒性实验：24小时内小时内一次一次或多次染毒或多次染毒 蓄积毒性实验：多次重复染毒蓄积毒性实验：多次重复染毒 二、按二、按染毒时间染毒时间分为：分为： 急性毒性实验：急

3、性毒性实验：24小时内小时内一次或多次染毒一次或多次染毒 亚急性毒性实验：亚急性毒性实验：130天重复染毒（短期重复染毒实验）天重复染毒（短期重复染毒实验） 亚慢性毒性实验：亚慢性毒性实验：13个月重复染毒个月重复染毒 慢性毒性实验：慢性毒性实验：3个月以上重复染毒个月以上重复染毒青大医学院公卫系 王树林52021-6-14 三、按三、按整个实验时间整个实验时间分为：分为： 短期毒性实验：实验数天至数周内完成，如：诱变短期毒性实验：实验数天至数周内完成，如：诱变实验实验 中期毒性实验：实验数周至数月内完成，如：特定中期毒性实验：实验数周至数月内完成，如：特定靶器官的致癌实验靶器官的致癌实验 长

4、期毒性实验（终生毒性实验）：数月至终生致癌长期毒性实验（终生毒性实验）：数月至终生致癌实验实验 多代毒性实验：实验须经历一代、二代或三代。如：多代毒性实验：实验须经历一代、二代或三代。如：繁殖实验繁殖实验青大医学院公卫系 王树林62021-6-14我国对农药、食品污染物、化妆品和我国对农药、食品污染物、化妆品和消毒剂等化学物毒性试验期限消毒剂等化学物毒性试验期限青大医学院公卫系 王树林72021-6-14 根据外源化学物种类的不同，急性毒性根据外源化学物种类的不同，急性毒性试验的程序和要求有所不同。但总体原试验的程序和要求有所不同。但总体原则和要点是相似的。主要包括：则和要点是相似的。主要包括

5、：青大医学院公卫系 王树林82021-6-14实验动物：实验动物：选择（种属、品系、清洁级别）选择（种属、品系、清洁级别）性别、年龄、体重性别、年龄、体重数量、分组数量、分组饲养环境饲养环境环境适应与检疫环境适应与检疫禁食禁食受试物：受试物：化学结构和理化性质化学结构和理化性质环节质控：批次、保管、分样、称重、配制环节质控：批次、保管、分样、称重、配制剂型：水溶液、混悬液、油溶液剂型：水溶液、混悬液、油溶液 （溶剂和助剂）（溶剂和助剂）材料材料青大医学院公卫系 王树林92021-6-14染毒方法染毒方法染毒剂量染毒剂量效应观察效应观察观察时间和周期观察时间和周期观察指标观察指标整体整体 一般观

6、察一般观察中毒体征及发生过程（发生时间）中毒体征及发生过程（发生时间）死亡情况及时间分布死亡情况及时间分布体重变化体重变化取材取材病理检查病理检查生化检验生化检验方法方法青大医学院公卫系 王树林102021-6-14结果统计和描述结果统计和描述中毒体征和时间关系中毒体征和时间关系死亡情况与时间关系死亡情况与时间关系剂量（反应）效应关系剂量（反应）效应关系生化检验结果的统计生化检验结果的统计病理检查结果的描述病理检查结果的描述分析讨论和评定分析讨论和评定分析讨论实验结果形成的原因分析讨论实验结果形成的原因分析讨论实验结果所揭示的问题分析讨论实验结果所揭示的问题对实验的评定对实验的评定对毒物的评定

7、对毒物的评定讨论讨论结果结果青大医学院公卫系 王树林112021-6-14 实验动物的选择原则：实验动物的选择原则： 尽量选择急性毒性反应尽量选择急性毒性反应与人近似与人近似的动物（种属）的动物（种属） 品系（如品系（如SD、Wistar大鼠等）纯化、适宜清洁级大鼠等）纯化、适宜清洁级别（影响因素易控）别（影响因素易控） 易于饲养易于饲养，试验动物，试验动物操作方便操作方便 繁殖生育力较强，数量较大能够繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应保障供应 价格较低，价格较低，易于获得易于获得动物动物 常用实验动物为大白鼠和小白鼠常用实验动物为大白鼠和小白鼠青大医学院公卫系 王树林122021-6-14

8、 性别性别 动物应当是动物应当是雌、雄各半雌、雄各半 如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性动物性动物各自的各自的LD 50值值 如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做雌性动物雌性动物的的LD 50试验试验青大医学院公卫系 王树林132021-6-14 年龄年龄 急性毒性试验选用的实验动物年龄通常要求急性毒性试验选用的实验动物年龄通常要求初成初成年年的动物，且为健康未交配和受孕的动物；亚慢的动物，且为健康未交配和受孕的动物；亚慢性

9、要求性要求性刚成熟性刚成熟，慢性要求，慢性要求初断乳初断乳。 体重体重 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的过该批动物平均体重的20。青大医学院公卫系 王树林142021-6-14实验动物的生活年限及体重选择实验动物的生活年限及体重选择青大医学院公卫系 王树林152021-6-14 数量数量 在利用不同的方法测定化学物在利用不同的方法测定化学物LD 50 时，实验时，实验设计中对动物数的要求不同设计中对动物数的要求不同 霍恩氏法测霍恩氏法测 LD 50时要求有时要求有 4个剂量组，个剂量组， 每组每组4或或 5只动物只动物 概

10、率单位法、概率单位法、Bliss法测定则要求法测定则要求57个剂量组，每个剂量组，每组组10只动物或只动物或10只以上只以上 对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量程确定实验动物数量青大医学院公卫系 王树林162021-6-14 分组：分组：均衡性均衡性和和随机性随机性 均衡性均衡性：要求各组动物的平均体重及体重的离：要求各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致。具体来说是散度尽可能一致。具体来说是（1）实验动物的体重不应超过全体实验动物平）实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的均体重的20-控制离散度控制离散度 （2）每组之

11、间的平均体重相差不应超过）每组之间的平均体重相差不应超过10-控制均衡性控制均衡性 随机性随机性：每只动物分散到各组去的机会是均等：每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见或系统误差的，以避免成见或系统误差青大医学院公卫系 王树林172021-6-14 实验动物的饲养环境（无特殊环境要求时）实验动物的饲养环境（无特殊环境要求时）应具有适宜性、清洁性、恒定性。应具有适宜性、清洁性、恒定性。 小气候：温度小气候：温度(223) 、湿度、湿度(3070%)、通风、通风、照明照明(昼夜各半昼夜各半)等。等。 笼具垫料笼具垫料 饮水饲料饮水饲料青大医学院公卫系 王树林182021-6-14 在选择

12、和购买实验动物后，应先进行动物的染毒前环在选择和购买实验动物后，应先进行动物的染毒前环境适应和检疫观察。境适应和检疫观察。 环境适应：让外购来的实验动物在本试验室条件下适应一环境适应：让外购来的实验动物在本试验室条件下适应一段时间，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响；段时间，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响； 筛检健康、体重等不符合试验要求的动物。在检疫期内出筛检健康、体重等不符合试验要求的动物。在检疫期内出现临床异常者应予放弃，不可用于试验。检疫期内雌雄必现临床异常者应予放弃，不可用于试验。检疫期内雌雄必须注意分笼饲养，防止交配和受孕。须注意分笼饲养，防止交配和受孕。 大鼠

13、、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周，犬、猴等适当地延周，犬、猴等适当地延长至长至23周。周。 青大医学院公卫系 王树林192021-6-14 禁食禁食 采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作禁食处理。禁食处理。 禁食时间：大鼠主要在夜间进食，所以要求染毒前应隔夜禁食时间：大鼠主要在夜间进食，所以要求染毒前应隔夜禁食。小鼠和大鼠基本类似，但由于其消化吸收和代谢速禁食。小鼠和大鼠基本类似，但由于其消化吸收和代谢速

14、度较快，可隔夜禁食也可禁食度较快，可隔夜禁食也可禁食4小时以上。大动物常在上午小时以上。大动物常在上午染毒，前一天正常给食，染毒前不喂食即可。染毒，前一天正常给食，染毒前不喂食即可。 禁食期间均正常给予饮水。染毒禁食期间均正常给予饮水。染毒2小时后提供饲料。小时后提供饲料。 经口多次染毒，可不禁食。经口多次染毒，可不禁食。 青大医学院公卫系 王树林202021-6-14 处理受试物时应了解：处理受试物时应了解： 受试物的纯度及杂质成分；受试物的纯度及杂质成分； 化学结构化学结构 理化性质：挥发性（熔点理化性质：挥发性（熔点/沸点）、溶解性、沸点）、溶解性、PH、稳定性。、稳定性。 化学结构和理

15、化性质相似化合物的毒性资料。化学结构和理化性质相似化合物的毒性资料。青大医学院公卫系 王树林212021-6-14 受试物要求：受试物要求： 分析纯分析纯 同一种、同一批号同一种、同一批号 成分和配方固定（如为异构体混合物，异构体成分和配方固定（如为异构体混合物，异构体比例必须固定）比例必须固定） 一次备齐一次备齐 所需受试物总量所需受试物总量=(ABCD) 1.2 A为每组动物数；为每组动物数；B为各处理组的剂量和；为各处理组的剂量和；C为染毒为染毒次数（通常为天）；次数（通常为天）；D为动物的平均体重；为动物的平均体重；1.2为安为安全因子，包含损耗量。全因子，包含损耗量。青大医学院公卫系

16、 王树林222021-6-14 处理受试物时每个环节都应处理受试物时每个环节都应质控质控批次批次运输运输保管保管分样分样称重称重配制配制贮存贮存青大医学院公卫系 王树林232021-6-14 常用剂型：水溶液、油溶液和混悬液。常用剂型：水溶液、油溶液和混悬液。 处理受试物时，所选溶剂或助剂的要求是：处理受试物时，所选溶剂或助剂的要求是： 无毒、无特殊刺激性和气味；无毒、无特殊刺激性和气味； 不与受试物发生反应，受试物在溶剂或助剂中不与受试物发生反应，受试物在溶剂或助剂中稳定；稳定； 不影响受试物的毒性（毒动学和毒效学）；不影响受试物的毒性（毒动学和毒效学）； 受试物在溶剂或助剂中稳定。受试物在

17、溶剂或助剂中稳定。青大医学院公卫系 王树林242021-6-14 一般毒性试验染毒途径一般毒性试验染毒途径(exposure routes)的选择应考虑几方面因素：的选择应考虑几方面因素： 模拟人在生活和生产环境中实际接触该受试物模拟人在生活和生产环境中实际接触该受试物的途径和方式；的途径和方式； 有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较； 受试物的性质和用途；受试物的性质和用途； 各种受试物毒性评价程序的要求等。各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。皮及注射途径。 青大医学

18、院公卫系 王树林252021-6-14 经口（胃肠道）染毒经口（胃肠道）染毒(oral exposure)经口经口途径：途径： 可分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。可分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。 经口灌胃染毒是急性毒性试验中最常用的染毒经口灌胃染毒是急性毒性试验中最常用的染毒途径。途径。 一般来说新的化学物均先进行经口染毒途径的一般来说新的化学物均先进行经口染毒途径的急性毒性试验，求出急性毒性试验，求出LD50值。值。 通常以经口途径的通常以经口途径的LD50值来比较不同化学物急值来比较不同化学物急性毒性大小。性毒性大小。 青大医学院公卫系 王树林262021-6-14 灌胃：灌胃： 空腹空

19、腹 灌胃后灌胃后2-3 h复食复食 灌胃的体积不超过体重的灌胃的体积不超过体重的1-2：小鼠为：小鼠为 0.21.0ml/只或只或0.10.5ml/10g较合适；大鼠为较合适；大鼠为5ml/只只(通常用通常用0.51.0ml/100g）；家兔为）；家兔为10ml/2kg体重；狗不超过体重；狗不超过50ml/10kg 青大医学院公卫系 王树林272021-6-14 经呼吸道染毒经呼吸道染毒 在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘状态污染活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道生产与生

20、活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入吸入 吸入接触分为两种方式吸入接触分为两种方式 静式吸入静式吸入 动式吸入动式吸入青大医学院公卫系 王树林282021-6-14 经皮肤染毒经皮肤染毒 研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。多选用家兔和豚鼠。 但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性 (求经皮求经皮LD 50)所需的实验动物较多，所需的实验动物较多， 使用家兔、豚鼠使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。不够经济，也常用大鼠代替。

21、青大医学院公卫系 王树林292021-6-14 经皮肤染毒程序经皮肤染毒程序 给予受试物前给予受试物前24 h，确定受试部位，确定受试部位 机械或化学脱毛机械或化学脱毛 面积面积10%15%体表面积体表面积 检查去毛部位有无异常现象检查去毛部位有无异常现象 单位体重相同容积染毒单位体重相同容积染毒 接触时间与人实际接触该化学物的时间相仿接触时间与人实际接触该化学物的时间相仿青大医学院公卫系 王树林302021-6-14 注射途径注射途径 可分为静脉注射或滴注、腹腔注射、肌肉注射、可分为静脉注射或滴注、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、椎管内注射等。使用注皮下注射、皮内注射、椎管内注射等。

22、使用注射途径染毒时需注意控制注射量、注射速度。射途径染毒时需注意控制注射量、注射速度。应调整受试物的应调整受试物的pH及渗透压，及渗透压，pH一般应为一般应为58，用用等渗溶液等渗溶液。 毒物代谢动力学研究，注射药品毒性毒物代谢动力学研究，注射药品毒性青大医学院公卫系 王树林312021-6-14常用实验动物给于受试物的体积（常用实验动物给于受试物的体积（ml）青大医学院公卫系 王树林322021-6-14 染毒剂量的确定染毒剂量的确定 剂量选择是一般毒性试验成功的基础。剂量选择是一般毒性试验成功的基础。 首先了解分析受试化学物的首先了解分析受试化学物的化学结构和其理化性质化学结构和其理化性质

23、，查阅，查阅文献，文献， 找出毒性资料，并以前期研究得到的找出毒性资料，并以前期研究得到的毒性参数毒性参数为基为基础设计础设计。 做做预试验。预试验。 每个剂量组间的每个剂量组间的组距可以大些组距可以大些，有利于找出受试化学物的，有利于找出受试化学物的致死剂量范围。致死剂量范围。青大医学院公卫系 王树林332021-6-14 观察时间和周期观察时间和周期 测定外源化学物的测定外源化学物的LD50(LC50)，一般要求计算，一般要求计算实验动物接触化学物之后两周（实验动物接触化学物之后两周（14天）内的总天）内的总死亡数死亡数 对于一些速死性化学物求其对于一些速死性化学物求其LD50(LC50)

24、 也可仅也可仅计算计算24小时的死亡率小时的死亡率 有些速死性化学物的有些速死性化学物的24小时小时LD50与两周与两周 LD50值往往没有差别值往往没有差别 但应注明是多少时间的但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础毒性比较时有共同的基础青大医学院公卫系 王树林342021-6-14中毒体征及发生过程（发生时间）中毒体征及发生过程（发生时间）实验动物的毒实验动物的毒性表现有一些规律，许多毒物染毒后，往往出现：性表现有一些规律，许多毒物染毒后，往往出现：兴奋兴奋抑制抑制死亡。死亡。含有氰基（含有氰基（CN）的氢氰酸和）的氢氰酸和丙烯腈对大鼠和小鼠染毒

25、丙烯腈对大鼠和小鼠染毒 抑制抑制死亡。死亡。N 苯甲酰基苯甲酰基 - （3，4 二氯苯基）二氯苯基） - 2 氨基氨基 丙酸乙酯，丙酸乙酯， 一般性的中毒表现，很快恢复，数日内均一般性的中毒表现，很快恢复，数日内均“安然无安然无恙恙”，近一周后才逐渐表现为抑制、拒食、消瘦、，近一周后才逐渐表现为抑制、拒食、消瘦、衰弱，昏迷直至死亡。二磷酸盐类药物衰弱，昏迷直至死亡。二磷酸盐类药物 青大医学院公卫系 王树林352021-6-14死亡情况及时间分布：死亡情况及时间分布：计算计算LD 50 体重变化：体重变化：有助于了解受试化学物所致的中毒效有助于了解受试化学物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应应

26、是短暂的或较长期的效应体重可以反映动物中毒后的整体变化体重可以反映动物中毒后的整体变化体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。损伤，也可能在体重上反映出来。青大医学院公卫系 王树林362021-6-14病理检查病理检查凡中毒死亡动物应及时

27、解剖做病理学检查，凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查， 检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变， 并对有变化的脏器作病理组织学检查并对有变化的脏器作病理组织学检查 对存活动物于观察期结束后应做病理学检对存活动物于观察期结束后应做病理学检 查查生化检验生化检验青大医学院公卫系 王树林372021-6-14 1、首先估算每只动物检测样本的量（如，、首先估算每只动物检测样本的量（如，采血量、肝脏、脾脏、肾脏重量）采血量、肝脏、脾脏、肾脏重量） 2、估算各检测项目需检测标本的量，是否、估算各检测项目需检测标本的量，是否能满足全部设计的检测项目。能满足全部设计的

28、检测项目。 3、首先应满足接触标志物和效应标志物，、首先应满足接触标志物和效应标志物，其次能反映靶标和有助于机制探索的检测其次能反映靶标和有助于机制探索的检测项目。项目。青大医学院公卫系 王树林382021-6-14 急性毒性概念急性毒性概念 急性实验目的急性实验目的 急性毒性实验方法要点急性毒性实验方法要点 急性毒性分级和评价急性毒性分级和评价青大医学院公卫系 王树林392021-6-14 （一）急性毒性概念（一）急性毒性概念 急性毒性急性毒性(acute toxicity)：是指机体是指机体(人或实人或实验动物验动物)一次一次或或24小时内多次小时内多次接触外源化学物接触外源化学物后在后在

29、短期内短期内(一般到一般到14天天)所产生的毒性效应。所产生的毒性效应。 包括一般行为、外观改变、大体改变及死亡效包括一般行为、外观改变、大体改变及死亡效应，最主要观察指标是应，最主要观察指标是LD50。 青大医学院公卫系 王树林402021-6-14 （二）注意事项（二）注意事项（1.染毒次数与时间）染毒次数与时间） 实验动物接触化学物的方式或途径不同，实验动物接触化学物的方式或途径不同， “一次一次”的含义也有所不同：的含义也有所不同： 经口和注射接触，经口和注射接触，“一次一次”是指在瞬间将受试化学物输入是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内实验动物体内 经呼吸道吸入与经皮肤接触，经呼吸

30、道吸入与经皮肤接触，“一次一次” 是指在一个特定是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程 所以所以“一次一次”含有时间因素含有时间因素青大医学院公卫系 王树林412021-6-14 （二）注意事项（二）注意事项（1.染毒次数与时间）染毒次数与时间） “24小时多次小时多次”的概念是指当外源化学物毒性的概念是指当外源化学物毒性很低，一次最大染毒给予实验动物后还不能达很低，一次最大染毒给予实验动物后还不能达到充分了解该毒物急性毒性作用的目的，从而到充分了解该毒物急性毒性作用的目的，从而在在24小时内分次染毒，即为小时内分次染毒，即为“多次多

31、次”。 国内一般规定为国内一般规定为24小时内不超过小时内不超过3次。次。青大医学院公卫系 王树林422021-6-14 （二）注意事项（二）注意事项（2.毒效应出现时间）毒效应出现时间） 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间来判定不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间来判定该毒物的某种毒性效应是否属于急性毒性，因为：该毒物的某种毒性效应是否属于急性毒性，因为： 有的化学毒物在实验动物接触数分钟内即可产生严重中有的化学毒物在实验动物接触数分钟内即可产生严重中毒症状，甚至瞬间死亡；毒症状，甚至瞬间死亡； 而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中毒而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中

32、毒症状和死亡，呈现迟发毒效应和死亡。症状和死亡，呈现迟发毒效应和死亡。 有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学物早期仅有较轻微症状，很快恢复，但在几天有的化学物早期仅有较轻微症状，很快恢复，但在几天后又出现严重中毒症状甚至死亡。后又出现严重中毒症状甚至死亡。青大医学院公卫系 王树林432021-6-14 （二）注意事项（二）注意事项（2.毒效应出现时间）毒效应出现时间） 一般急性大剂量染毒可引起速发毒性也能引起一般急性大剂量染毒可引起速发毒性也能引起迟发毒性，可能产生也可能不产生与重复染毒迟发毒性，可能产生也可能不产生与重复染毒

33、类似的毒性。类似的毒性。 应主要以接触毒物的时间，规定的应主要以接触毒物的时间，规定的“一次或一次或24小时内多次接触小时内多次接触”后所产生的毒性效应。后所产生的毒性效应。 观察急性毒效应一般为观察急性毒效应一般为14天，如有必要可延长天，如有必要可延长至至14天以上。天以上。 青大医学院公卫系 王树林442021-6-14 （二）注意事项（二）注意事项（3.毒效应强度）毒效应强度） 急性毒性与亚慢性、慢性中毒相比其症状常常急性毒性与亚慢性、慢性中毒相比其症状常常是很剧烈的，机体急性一次性大剂量接触毒物是很剧烈的，机体急性一次性大剂量接触毒物后所表现出的一般行为，外观、大体形态的改后所表现出

34、的一般行为，外观、大体形态的改变十分明显，中毒症状严重，常常发生死亡。变十分明显，中毒症状严重，常常发生死亡。 急性毒性常常以急性毒性常常以死亡死亡为观察重点和观察终点。为观察重点和观察终点。 青大医学院公卫系 王树林452021-6-14 各个剂量组的确定各个剂量组的确定 急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照组，有不同意见。但在实际工作中，除有特殊规定外，均不组，有不同意见。但在实际工作中，除有特殊规定外，均不设立设立对照组对照组。 剂量组数需根据试验设计所选用的剂量组数需根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定计算方法来

35、确定。如寇氏法、如寇氏法、Bliss法一般设法一般设58个剂量组；霍恩氏法设个剂量组；霍恩氏法设4个剂个剂量组。量组。 利用外源化学物利用外源化学物LD 50 时设置剂量组，应依时设置剂量组，应依预试验结果预试验结果而定而定 一般设置一般设置57个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大只、大 鼠鼠68只、家兔只、家兔46只只青大医学院公卫系 王树林462021-6-14经典急性毒性剂量确定与分组经典急性毒性剂量确定与分组阴性对照组阴性对照组低剂量组低剂量组(

36、 (毒性作用明显，但没有或仅有个毒性作用明显，但没有或仅有个别动物死亡，相当于别动物死亡，相当于LD0LD0) )中剂量组中剂量组( (毒性作用明显，有毒性作用明显，有50%50%动物死亡，动物死亡，相当于相当于LD50LD50) )高剂量组高剂量组( (介于介于LD50-LD95LD50-LD95之间之间) )溶剂对照组溶剂对照组1.1.阳性对照阳性对照青大医学院公卫系 王树林472021-6-14 （三）急性实验目的（三）急性实验目的 1. 测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，通常以通常以LD50（半数致死剂量）为最主要的参数，并根（

37、半数致死剂量）为最主要的参数，并根据据LD50值进行急性毒性分级。值进行急性毒性分级。 2. 通过观察动物中毒表现、通过观察动物中毒表现、毒作用毒作用强度和强度和死亡死亡情况，情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。 3. 为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的供接触剂量和观察指标选择的依据依据。 4. 为毒理学机理研究提供为毒理学机理研究提供线索线索。青大医学院公卫系 王树林482

38、021-6-14 （四）急性毒性实验应用：（四）急性毒性实验应用： 了解外源化学物对机体产生急性毒性的主要依了解外源化学物对机体产生急性毒性的主要依据，是毒理学研究中最基础的工作。据，是毒理学研究中最基础的工作。 对于和人类生活密切接触的化学物如新的食品、对于和人类生活密切接触的化学物如新的食品、药品、农药、化妆品、工业毒物等毒理学安全药品、农药、化妆品、工业毒物等毒理学安全性评价，通常是必做的试验。性评价，通常是必做的试验。 是评估毒性大小的第一步工作。是评估毒性大小的第一步工作。青大医学院公卫系 王树林492021-6-14 （五）急性毒性实验分类（五）急性毒性实验分类 1.经典急性毒性实

39、验：经典急性毒性实验：以以死亡死亡为其观察终点，为其观察终点，所需实验动物所需实验动物数量多数量多。 概率单位法概率单位法 改进寇氏法改进寇氏法 霍恩法（霍恩法（Horn）青大医学院公卫系 王树林502021-6-14 经典急性毒性试验的局限性经典急性毒性试验的局限性 1.消耗的动物量大消耗的动物量大 2.获得的信息有限获得的信息有限 3.测得的测得的LD50仅仅是一个近似值仅仅是一个近似值 4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。及

40、其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。青大医学院公卫系 王树林512021-6-14 2.急性毒性替代实验：急性毒性替代实验：减少减少了实验动物数量；优了实验动物数量；优化了动物实验。向化了动物实验。向3R方向发展。方向发展。 1）固定剂量法固定剂量法(fixed dose procedure)：不以死不以死亡为观察终点；固定剂量。亡为观察终点；固定剂量。 利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学无毒性进行分级。化学物的毒性反应来对化学无毒性进行分级。青大医学院公卫系 王树林522021-6-14 2.急性毒性替代实

41、验：急性毒性替代实验： 2）急性毒性分级法急性毒性分级法(acute toxic class method)：以死亡为观察终点；分阶段实验。以死亡为观察终点；分阶段实验。 每阶段每阶段3只动物，根据死亡动物数，判定毒性。只动物，根据死亡动物数，判定毒性。 3）上上-下移动法下移动法(up/down method) 或阶梯法：或阶梯法： 多种观察终点；初步资料多种观察终点；初步资料 第一只动物剂量第一只动物剂量 毒性反应毒性反应 第二只动物剂量第二只动物剂量 青大医学院公卫系 王树林532021-6-14 我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少

42、缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。 目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准。目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准。 急性毒性试验求出急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过值，通过LD50值进行值进行急性毒性分级急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价，评价毒物的急性毒性的强弱，比较毒物的急性毒性大小。毒物的急性毒性的强弱，比较毒物的急性毒性大小。 应注意急性毒性试验结束时，除报告该毒物的应注意急性毒性试验结束时，除报告该毒物的LD50值和急值和急性毒性级别外，还应对中毒和死亡特征加以报告

43、。性毒性级别外，还应对中毒和死亡特征加以报告。青大医学院公卫系 王树林542021-6-14 在毒理学中为什么选用在毒理学中为什么选用LD50作为判断化合物急性毒作为判断化合物急性毒性的分级指标？性的分级指标？ LD50是通过对各试验组的数据进行统计分析得来的，其作是通过对各试验组的数据进行统计分析得来的，其作为判断化合物急性毒性的分级指标的原因是：为判断化合物急性毒性的分级指标的原因是：LD50代表受试群体感受性的代表受试群体感受性的平均平均情况，因而代表性好。情况，因而代表性好。位于剂量反应关系位于剂量反应关系S形曲线形曲线中央中央，LD50不受两端个别动物不受两端个别动物感受性特高或特低

44、的影响。感受性特高或特低的影响。此处曲线的此处曲线的坡度最大坡度最大，因而，因而LD50灵敏性高。灵敏性高。其附近的曲线其附近的曲线近似直线近似直线，因而，因而LD50稳定性好。稳定性好。死亡比非死亡的许多效应便于死亡比非死亡的许多效应便于准确准确观察。观察。青大医学院公卫系 王树林552021-6-14青大医学院公卫系 王树林562021-6-14青大医学院公卫系 王树林572021-6-14 局部刺激实验局部刺激实验目的目的是了解外源化学物对眼睛和皮肤的局部是了解外源化学物对眼睛和皮肤的局部刺激作用和腐蚀作用。刺激作用和腐蚀作用。包括包括眼刺激实验、皮肤刺激和致敏实验。眼刺激实验、皮肤刺激

45、和致敏实验。我国农药、化学品和消毒剂毒理学实验程序我国农药、化学品和消毒剂毒理学实验程序均规定局部刺激实验为均规定局部刺激实验为必做项目必做项目。青大医学院公卫系 王树林582021-6-14 由由FDA John Draize于于1944年建立。年建立。 作为眼刺激和皮肤刺激鉴定实验。作为眼刺激和皮肤刺激鉴定实验。 局限性：局限性： 实验评分主观性强；实验评分主观性强； 结果重复性差；结果重复性差； 种属差异。种属差异。青大医学院公卫系 王树林592021-6-14 一、概述一、概述 眼睛刺激性眼睛刺激性(Eye Irritation)：指眼球表面接触受：指眼球表面接触受试样品后产生的可逆性

46、炎性变化。试样品后产生的可逆性炎性变化。 眼睛腐蚀性眼睛腐蚀性(Eye Corrosion)：指眼球表面接触受：指眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤。试样品后引起的不可逆性组织损伤。青大医学院公卫系 王树林602021-6-14 二、试验基本原则二、试验基本原则 受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照；膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照； 在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评价受试样品对眼睛的刺激作作用程

47、度并评分，以此评价受试样品对眼睛的刺激作用。观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可用。观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性。观察时间最少逆性。观察时间最少72h，一般，一般7d，但一般不超过，但一般不超过21d； 当动物出现严重和持久的痛苦迹象时，以适当的方式当动物出现严重和持久的痛苦迹象时，以适当的方式将动物处死；将动物处死；青大医学院公卫系 王树林612021-6-14 三、实验动物及动物数量三、实验动物及动物数量 首选家兔。一般首选家兔。一般4只。只。 如果受试样品的显著效应是可预见的，可以考如果受试样品的显著效应是可预见的，可以考虑用一只动物。如果用一只动物试验得出的结虑

48、用一只动物。如果用一只动物试验得出的结果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性，则果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性，则不必进行进一步的试验。如果结果相反，则至不必进行进一步的试验。如果结果相反，则至少需要少需要3只家兔。有时，在增加动物的进一步只家兔。有时，在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑反应。试验中应该适当的阐明可疑反应。 青大医学院公卫系 王树林622021-6-14 四、不适宜做眼刺激实验的情况：四、不适宜做眼刺激实验的情况： 强酸或强碱物质如强酸或强碱物质如pH2或或pH11.5，由于其可，由于其可预见的腐蚀特性，不必做本试验；预见的腐蚀特性，不必做本试验； 已在皮肤试验中证

49、实具有腐蚀或严重刺激毒性已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试验，可以推测该物质的物质不必进行眼刺激试验，可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果；对眼睛将会引起相似的严重结果； 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验。刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验。青大医学院公卫系 王树林632021-6-14 五、结果五、结果 急性眼刺激试验结果从动物外推到人的可靠性急性眼刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物

50、质较人类敏感。若用其它品系动或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。物外推到人的可靠性。青大医学院公卫系 王树林642021-6-14 一、概述一、概述 皮肤刺激性皮肤刺激性(Dermal Irritation)：皮肤涂敷受试：皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性变化。样品后局部产生的可逆性炎性变化。 皮肤腐蚀性皮肤腐蚀性(Dermal Corrosion)：皮肤涂敷受：皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤。试样品后局部引起的不可逆组织损伤。青大医学院公卫系 王树林652021-6-14

51、 二、试验基本原则和要求二、试验基本原则和要求 1、将受试样品一次（或多次）涂（敷）于健康无破损的、将受试样品一次（或多次）涂（敷）于健康无破损的皮肤上，并作自身对照（除非怀疑有严重的刺激皮肤上，并作自身对照（除非怀疑有严重的刺激/腐蚀并腐蚀并逐渐发展）；逐渐发展）； 2、在规定时间间隔内观察和评价刺激反应的程度，并作、在规定时间间隔内观察和评价刺激反应的程度，并作详细的记录。详细的记录。 3、试验前、试验前24h，将实验动物脊柱两侧毛剪去或剃掉，不，将实验动物脊柱两侧毛剪去或剃掉，不可损伤表皮，去毛范围左右各可损伤表皮，去毛范围左右各3cm3cm。24h后，选择后，选择皮肤健康完整无损的动物

52、进行试验。不应在长有浓密岛状皮肤健康完整无损的动物进行试验。不应在长有浓密岛状毛的部位进行受试样品试验。毛的部位进行受试样品试验。青大医学院公卫系 王树林662021-6-14 二、试验基本原则二、试验基本原则 4、取受试样品直接涂布在皮肤上，用二层纱布和、取受试样品直接涂布在皮肤上，用二层纱布和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为敷用时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂清除残留受试样品。溶剂清除残留受试

53、样品。 5、观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺、观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺激作用的全过程，以便进行完整的评价，一般不超激作用的全过程，以便进行完整的评价，一般不超过过14d。 青大医学院公卫系 王树林672021-6-14 三、实验动物和饲养环境三、实验动物和饲养环境 首选健康成年白色家兔，其次为白色豚鼠。如果使用首选健康成年白色家兔，其次为白色豚鼠。如果使用其他的哺乳动物做试验，试验者应提供选择的依据。其他的哺乳动物做试验，试验者应提供选择的依据。 至少需要至少需要4只健康成年动物（雄性和只健康成年动物（雄性和/或雌性均可），每或雌性均可），每只动物相邻的未处理的皮肤可作

54、为对照。只动物相邻的未处理的皮肤可作为对照。 实验动物应单笼饲养，试验前动物要在动物实验室中实验动物应单笼饲养，试验前动物要在动物实验室中至少适应至少适应3d时间。时间。 实验动物和动物实验室应符合国家相应规定。常规饲实验动物和动物实验室应符合国家相应规定。常规饲料喂养，自由饮水。料喂养，自由饮水。 青大医学院公卫系 王树林682021-6-14 四、不适宜做皮肤刺激实验的情况：四、不适宜做皮肤刺激实验的情况： 强酸或强碱物质如强酸或强碱物质如pH2或或pH11.5，由于可预见其腐，由于可预见其腐蚀特性，不必做本试验；在充分并公认的体外试验结蚀特性，不必做本试验；在充分并公认的体外试验结果中确

55、定可能产生腐蚀或刺激毒性的物质不必进行体果中确定可能产生腐蚀或刺激毒性的物质不必进行体内试验。如果从受试样品的结构活性构效关系可以预内试验。如果从受试样品的结构活性构效关系可以预见潜在的腐蚀毒性，则不必做本试验。见潜在的腐蚀毒性，则不必做本试验。 若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性（LD50200mg/kg bw）的物质（系统毒性）不必进）的物质（系统毒性）不必进行本试验；行本试验； 在急性经皮毒性试验中染毒剂量达在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kg bw时仍时仍未产生皮肤刺激体征的物质。未产生皮肤刺激体征的物质。青大医学院公卫系 王树林69202

56、1-6-14 五、结果五、结果 急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。试验中使用封闭式接动物外推到人的可靠性。试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验，在人类触是一种超常的实验室条件下的试验，在人类实际接触化学品过程中很少存在这种接触方式。实际接触化学品过程中很少存在这种接触方式。青大

57、医学院公卫系 王树林702021-6-14 一、离体细胞、组织器官模型一、离体细胞、组织器官模型 指利用废弃的离体动物眼球、角膜作为眼刺激试验材料替指利用废弃的离体动物眼球、角膜作为眼刺激试验材料替代整体动物的试验。目前开展的主要有代整体动物的试验。目前开展的主要有 离体鸡眼试验离体鸡眼试验( chicken enucleated eye test, CEET) 、 离体兔眼试验离体兔眼试验( isolated rabbit eye test, IRE) 、 牛角膜混浊与渗透力牛角膜混浊与渗透力( bovine corneal opacity and permeability, BCOP)影响

58、试验影响试验 体外细胞培养体外细胞培养： 人角朊细胞人角朊细胞,以避免不同种属之间结果外推的不确定性。以避免不同种属之间结果外推的不确定性。 皮肤成纤维细胞培养皮肤成纤维细胞培养 皮肤组织培养皮肤组织培养青大医学院公卫系 王树林712021-6-14 二、绒毛膜尿囊膜二、绒毛膜尿囊膜( chorioallantoic membrane, CAM )试验试验 绒毛膜尿囊膜是鸡胚外的循环系统绒毛膜尿囊膜是鸡胚外的循环系统,与眼结膜组与眼结膜组织结构相似，是眼刺激性试验替代方法中广泛使用织结构相似，是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。目前研究的主要有的模型之一。目前研究的主要有 鸡胚绒毛膜尿

59、囊膜鸡胚绒毛膜尿囊膜( hens egg2chorioallantoic membrane, HET2CAM)试验、试验、 绒毛膜尿囊膜绒毛膜尿囊膜-台盼蓝染色台盼蓝染色( chorioallantoic membrane-trypan blue straining, CAM-TBS)试验试验 绒毛膜尿囊膜血管试验绒毛膜尿囊膜血管试验( chorioallantoic membrane vas-cular assay, CAMVA) 。青大医学院公卫系 王树林722021-6-14 一、概述一、概述 皮肤致敏反应皮肤致敏反应/过敏性接触性皮炎过敏性接触性皮炎(Skin Sensitizatio

60、n/Allergic Contact Dermatitis)：是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。对于人类这种反应可能以搔痒、红斑、丘疹、对于人类这种反应可能以搔痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。能只见到皮肤红斑和水肿。青大医学院公卫系 王树林732021-6-14 二、试验基本原则二、试验基本原则 1、诱导接触、诱导接触(Induction Exposure)：指机体：指机体通过接触受试样品以达到诱导产生致敏状态目通过接触受试样品以达到诱导产生致敏状态目的的试验性