细胞培养技术

1、哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心Liao Y L, Hu L Y, Tsai K W, et al. Transcriptional regulation of miR-196b by ETS2 in gastric cancer cellsJ. Carcinogenesis, 2012: bgs031. IF=5.266The polymerization and depolymerization of F-actin are essential for cell motility. To assess whether the observed arrangements of the

2、actin cytoskeleton could affect the migration of shETS2- or lenti-196b-treated AGS cells, we examined cellular actin structure with phalloidine staining. The F-actin positive membranep r o t r u s i o n s w e r e significantly increased in addition to the F-actin organization enhancement in the shET

3、S2- or lenti-196b-treated AGS cells细胞培养基础知识相关实验仪器使用细胞学相关实验细胞培养教学视频哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 细胞培养基础知识细胞培养基础知识哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 一、概念：一、概念：细胞培养是指从器官、组织中分离出细胞并在体外模拟体内生理环境在无菌、适当的温度和一定的营养条件下使之生长生存，维持结构和功能的培养方法。（培养物是单个细胞或细胞群）哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心二、细胞培养的优点及局限性二、细胞培养的优点及局限性u优点：u能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动，应用领域广。u便于观察、记录

4、、摄影，直接观察细胞变化。 u可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞皆可。 u便于使用不同方法研究细胞。u培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分。u可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少。u易于施加物理、化学和生物因素进行实验。 u生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产必要手段。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心u局限性局限性： 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果与体内环境相比，仍有很大差异

5、。故实验结果不能推至体不能推至体内内，轻易做出与体内等同的结论。，轻易做出与体内等同的结论。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 三、细胞培养特性细胞培养特性（一）生长方式 根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴附生长和悬浮生长。 1.贴附生长 是指细胞附着于支持物表面生长。贴壁生长的细胞从形态学上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型两种哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（1）成纤维型细胞u细胞体呈梭形或不规则三角形或者是扇形，中央 有卵圆形核，胞质突起，其生长特点为不紧密相连，多呈放射状，漩涡状或栏栅状。u成纤维细胞 、心肌、平滑肌、成骨细胞、骨髓基质干细胞等 哈尔滨医科大学附属第二医院科

6、研实验中心（2）上皮型细胞u扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。其生长特点为细胞紧密相连，呈“铺路石”状u消化管外皮细胞、肝、胰、肺泡上皮、血管内皮等 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（3）其他贴附型细胞 游走型细胞u在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则u神经胶质细胞哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 多形型细胞u难以确定其规律和稳定的形态 u神经组织细胞哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心2.悬浮生长 不需要支持物，而悬浮于培养基中生长，多呈圆形。一般多来自于血液、脾或骨髓细胞。 悬浮型u见于各种造

7、血系统肿瘤细胞和血液细胞u胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长u容易大量繁殖 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）生长特性1、接触抑制：细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现象。细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖,这种现象就叫做接触抑制。（肿瘤细胞不受影响）2、密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density I

8、nhibition），导致细胞分裂停止。（肿瘤细胞受影响）哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心四、细胞培养所需仪器设备及用品四、细胞培养所需仪器设备及用品（一）无菌操作环境（一）无菌操作环境1.无菌操作区：只限于细胞培养，独立的区域或与外界隔离，备有紫外杀菌条件（主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 ）；2.个人：无菌服、无菌室专用鞋，并且带上口罩和帽子；哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）设备（二）设备1.超净工作台：为细胞操作提供无菌环境2.显微镜：倒置显微镜、荧光显微镜等；3.CO2培养箱； 4.干烤箱 5.高压锅6.纯水器、离心机、液氮罐、天平等；哈尔滨医

9、科大学附属第二医院科研实验中心（三）用品（三）用品1.滤器：细胞培养用的培养基、消化液中含有多种生物活性物质，这些物质在高温和射线的照射下易失去功能，必须用滤器除菌；2.培养瓶、培养板、吸管、加样器等。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心五、细胞生长条件细胞生长条件（一）营养物质（一）营养物质 细胞生长所需的营养物质包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子以及各种促生长因子等。血清中含有多种细胞生长所需的营养物质。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 血清血清 血清可来自多种动物，目前用于组织培养的血清主要是牛血清，在培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。 n小牛血清：小牛血清取自出生1

10、030天的小牛。n新牛血清：新牛血清取自出生24小时之内的新生牛。n胎牛血清：胎牛血清应取自剖腹产的胎牛，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）生长环境（二）生长环境 a.温度:哺乳动物细胞适宜温度范围35-37。 b.pH值：CO2是细胞的代谢产物也是细胞生长的必要条件细胞培养箱中通入一定量的CO2（一般5%）可使培养箱中的PH值保持在7.2-7.4之间。 c.湿度：相对湿度100%。CO2培养箱中要放置水槽，用以防止培养瓶（皿）中液体蒸发。 d.环境清洁无污染 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验

11、中心（三）细胞培养所需的液体（三）细胞培养所需的液体 A 水：细胞培养所需纯净水包括蒸馏水和离子交换水两种。 B 平衡盐液：它是等渗液体，不含钙镁离子。用于冲洗细胞。包括：HanKs液，D-HanKs液及PBS液等。 C 消化液：u 胰蛋白酶液：一般浓度0.25%u EDTA液：常用浓度是0.02%u 胰酶-EDTA混合液：将上述两种液体按1：1混合即可。 两种消化液联合使用可提高消化效率。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心D 培养基：主要有天然和合成两种：l天然培养基：包括生物体液和组织液等；l合成培养基：目前常用：IMEM、F12K、RPMl-l640、DMEM培养液等，它是由多种物质

12、混合而制成的成品合成培养基，只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长，使用时需添加天然培养基，主要是牛血清 。根据细胞的种类选取不同的合成培养基。 ( (ATCCATCC//) )l其他：无血清培养基。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心E 抗生素在离散细胞或培养细胞过程中，加入适量抗生素，可预放操作不慎而产生的污染。常用的有：l青霉素 100ug/mll链霉素 100ug/mll卡那霉素50ug/mll庆大霉素50ug/mll二性霉素2.5ug/ml等。 常配成1:100倍或1:200倍使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻

13、保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（一）无菌操作前准备；（一）无菌操作前准备；1 进入无菌室前，应洗手以保持清洁。在缓冲间换无菌室专用拖鞋和穿无菌服。2 将废液桶放入超净台内，然后将超净台的紫外灯打开，杀菌20-30分钟，重复步骤1。3 培养基等液体最好恢复室温，如是较难培养的细胞，在操作前液体一定要预温。4 实验用品：做好计划、按需领取并做好登记。注意：注意：紫外灯打开时，不要将培养基、消化液等放在室内和 超净台内。 六、细胞培养流程六、细胞培养流程 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）细胞培养操作（二）细胞培养操作 1 操作时用

14、酒精棉擦手，装液体的瓶子外面也要用酒精棉擦拭后再放在超净台内。 2 物品摆放：酒精灯应放在操作者的正前方，废液桶和培养基等液体要放在酒精灯的两侧；并重新用酒精棉擦手。 3 用镊子挟取吸管、瓶塞等物品时先要在酒精灯上过火。 4 培养基、PBS等，打开瓶塞后最好倾斜放置，培养瓶开口后尽可能放在酒精灯的附近。 5 打开或盖上瓶塞时，瓶塞和瓶口都要在酒精灯上过火，烧瓶口时应对着火焰烧瓶颈。盖胶塞时应用旋转的方法，不要用镊子压胶塞的顶部，以免用力过大或受力不均打碎瓶子。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 6 吸管的使用：拿吸管用执笔的方法，吸管在酒精灯上过火时间不要太长，以免造成培养基中的生物活性物

15、质和消化液中酶活性失效。吸过液体的吸管不能再在酒精灯上过火。吸管操作要稳，向培养瓶加液体时不要滴在瓶口或瓶外壁，以免造成污染。 7 如果培养两种以上细胞时要分批操作，避免交叉污染； 8 从培养箱取出培养瓶时应水平或瓶口上倾；往培养箱放培养瓶前，要检查瓶壁外是否有液体，如有要用酒精棉擦去。 9 培养箱要轻开轻关。培养箱水槽内水量要保持在总体积一半以上。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心10.10.以原代培养和传代培养为例介绍培养过程以原代培养和传代培养为例介绍培养过程原代培养原代培养：是指从组织中分离出细胞后在体外进行的首次培养。l 原代培养的方法：组织块法和酶消化法。l 原代培养的注意事项

16、： （1）原代培养时一定将组织中的血管和外膜等除干净。 （2）组织块法时，组织不应过大一般剪成1mm3左右大小。然后将组织块平铺在培养皿上，先不要加培养液，放置15-30分钟后加入少量液体，24小时后再补加培养液。 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 （3）采用消化法时，要将组织块剪成泥状，不同组织要用不同的消化液，消化液浓度和消化时间也不相同，如果培养的不是成纤维细胞，要采用差速贴壁的方法去除成纤维细胞。 （4）原代培养的细胞需要进一步纯化。酶消化法，机械刮除法等。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心传代培养传代培养是指原代培养的细胞增殖成单层后；或者是细胞铺满瓶底后；再或者是悬浮生长

17、的细胞增殖到一定程度后，我们将其稀释，然后传到新的培养瓶的过程。n贴壁生长的细胞用酶消化法传代；n半贴壁细胞可直接吹打后分瓶；n悬浮生长细胞要先吹打再离心，然后将沉淀稀释分瓶。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心操作步骤：操作步骤：倒掉旧培养液用平衡盐液（多用PBS）冲洗细胞后弃掉;加入消化液，要使消化液浸过细胞层面，然后弃掉;消化2-3分钟（禁止放入培养箱）;镜下观察，当细胞变圆变亮时应终止消化。胰酶消化时可直接加含有血清的培养基吹打细胞后分瓶；如用EDTA消化需用Hanks液终止，混合液需先终止后离心然后分瓶;注意：注意： 无论是在培养瓶中还是在离心管中操作都要用吸管吹打细胞，使其成为单

18、个细胞悬液，然后均匀的分到两个瓶中。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心细胞培养中可能遇到的问题细胞培养中可能遇到的问题：1.细胞不贴壁或少贴壁2.细胞成团或分散不均匀3.细胞生长缓慢4.培养瓶中出现残渣5.细胞污染（细菌、真菌等）哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（三）无菌操作后（三）无菌操作后l无菌操作结束后，将废液桶等物品取出，用酒精绵擦拭台面并将台内物品摆放整齐，关闭通风、照明，将台内紫外打开；l查看显微镜、离心机等设备电源是否关闭；l将掉到地面上的废弃物捡起，如果有液体撒在地面上，要用清水擦拭。哈尔滨

19、医科大学附属第二医院科研实验中心（四）无菌室清扫（四）无菌室清扫l依据 科研实验中心细胞培养间清洁规范进行l安排值日哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心七、细胞冻存与复苏七、细胞冻存与复苏（一）细胞冻存：1.细胞冻存时机：贴壁率为85%-95%的对数生长期细胞。2.冻存液：含有5%-7%二甲基亚砜的血清液3.冻存要求：冻存前一天换液；冻存液中细胞的终浓度以1-5x106/ml为宜；冻存时温度应逐渐降低；首次冻存时应复苏一支观察其冻存效果。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）细胞复苏二）细胞复苏 细胞复苏时应在37水浴锅中迅速融解，操作如下： u 准备好培养液（预温）和离心管u 将冻存

20、管从液氮中取出迅速放入纯净的37水中，待融解到还有黄豆粒大小冰块时取出；u 将含有细胞的冻存管用酒精消毒后，将细胞悬液吸出放入离心管；u 加一管常温的培养液混匀；u 800-1000转/分离心，弃上清后加培养液，混合后移入培养瓶中。哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心细胞培养的核心原则是什么？ 无菌操作无菌操作哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 天平的使用1.调水平：每天平开机前，应观察天平后部水平仪内的水泡是否位于圆环的中央，否则通过天平的地脚螺栓调节，左旋升高，右旋下降。2.预热：天平在初次接通电源或长时间断电后开

21、机时，至少需要30分钟的预热时间。因此，实验室电子天平在通常情况下，不要经常切断电源。3.称量：按下ON/OFF键, 接通显示器;等待仪器自检。当显示器显示零时，自检过程结束，天平可进行称量；放置称量纸，按显示屏两侧的Tare键去皮，待显示器显示零时，在称量纸加所要称量的试剂称量。称量完毕，按ON/OFF键, 关断显示器。相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心注意事项注意事项 1.为正确使用天平，请您熟悉天平的几种状态：显示器右上角显示O：表示显示器处于关断状态；显示器左下角显示O：表示仪器处于待机状态，可进行称量；显示器左上角出现菱形标志：表示仪器的微处理器正

22、在执行某个功能，此时不接受其他任务。2.天平在安装时已经过严格校准，故不可轻易移动天平，否则校准工作需重新进行。3.严禁不使用称量纸直接称量！每次称量后，请清洁天平，避免对天平造成污染而影响称量精度，以及影响他人的工作。 相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 使用方法使用方法 1. 以旋转的方式把PH电极从保护帽中拔出，冲洗后定标。2. 定标后将PH电极用蒸馏水清洗后，将PH电极头浸入待测样品中（4cm）并用搅拌棒搅拌进行测样。3. 停几分钟让PH电极读数稳定。4. 将显示静止在终点数值上读取数据。5. 测量后，将电极用蒸馏水清洗，旋入保护帽中。相关实验仪器使

23、用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心注意事项注意事项 1.每次使用前必须定标：4.01 7.0 10.01 2.在将电极从一种溶液移入另一种溶液之前，用蒸馏水清洗电极。用纸巾将水吸干，切勿擦拭电极。3.小心使用电极，切勿将之用作搅拌棒。在拿放电极时，勿接触电极膜。4.随时留意电极保护液是否干涸，请通知仪器分析技术员填充。将灌有正确保护液的电极竖直放置。 5.做好使用登记。相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心使用方法使用方法 1、打开进水压力阀。 2、仪器显示： PRE-OPERATEPRE-OPERATE状态。 3、向下扳动操作手柄上的开关

24、，仪器显示：18.2M.CM系统 即可开始工作。注意事项注意事项 1、随时注意，进水桶内液面，避免 进水管露出水面。 2、注意节约用水，不用时及时关闭 出水阀。相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心使用方法使用方法: :通电前首先在水箱中加入适量水，最好选用蒸馏水，切勿无水或水位低于电热管、以防电热管爆损。接通电源，打开开关设置温度设置温度按按SET键绿色数字闪动按“”“”键到所需温度后按“”键到所需温度后按按SET键确认。注意事项注意事项: :1.水浴锅在使用时，必须可靠接地、水不可溢入控制箱内以免发生危险。2.必须按规定使用，切不可缺水，否则造成设备损坏。3

25、.使用时必须登记相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心使用方法：使用方法：1打开电源2. 调节所需风速3. 使用的时候人坐于柜前，将玻璃门尽量放低，手通过门下伸进柜内进行实验。4. 使用后关闭电源相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心注意事项注意事项: :n1 消毒期间严禁打开风机，始终保持工作台内“死屏” 即无空气对流效果。n2. 工作台使用后即刻以75%酒精擦净污渍；紫外灯消毒30分钟后关机。n3.经常用沙布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面揩擦干净，保持表面清洁，n以免影响紫外灯消毒效果。n4. 使用时必须登记相关实验仪器使用相关实

26、验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心l1准备l1.1检查离心腔体有无异物l1.2通电前应检查仪器电源线是否连接正常.l2.开机l设定参数：l1）按设定键“SET”l2）将离心参数输入。按“” “”键后按确定键“ENTER”以示确认。l3.运行相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心注意事项：注意事项：1每次修改参数后，必须按一次“设定确认”键，否则离心机将保持原有工作状态，对设定的参数不予理睬。2把经过平衡的样本放入离心机，按运行键“STARE”，离心机将自动运行。3清理系统和关机4清理离心腔杂物，关闭电源。5.使用时必须登记。相关实验仪器使用相关实验

27、仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心开机，接连电源。打开镜体下端的电控开关。(1)准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。 (2)调节光源：推拉调节镜体下端的亮度至适宜。通过调节聚光镜下面的光栅来调节光源的大小。 (3)调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜;更换并选择合适的目镜;同时调节升降， 以消除或减小图像周围的光晕，提高了图像的衬度。 (4)观察：通过目镜进行观察结果;调整载物台，选择观察视野。(5)关机取下观察对象，推拉光源亮度调节器至最暗。关闭镜体下端的开关，并断开电源。旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台

28、下侧，防止灰尘的沉降。 相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心n1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用软毛刷轻轻的掸去掉。 n2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液(3:7)轻轻擦拭。 n3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。 n4.在任何情况下操作人员不能用棉团、干布块或干镜头纸擦试镜头表面，否则会刮伤镜头表面，严重损坏镜头，也不要用水擦试镜头，这样会在镜头表面残留一些水迹，因而可能滋生霉菌，严重损坏显微镜。 n5.仪器工作的间歇期间，为了防止灰尘进入

29、镜筒或透镜表面，可将目镜留在镜筒上，或盖上防尘塞，或用防尘罩将仪器罩住。 n6.微镜尽可能不移动，若需移动应轻拿轻放，避免碰撞。 n7.不允许随意拆卸仪器，特别是中间光学系统或重要的机械部件，以免降低仪器的使用性能。相关实验仪器使用相关实验仪器使用哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心注意事项：1.严格遵守操作要求2.在仪器使用记录上签字3.遇到问题及时与老师联系哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心相关实验仪器使用相关实验仪器使用细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心一、细胞计数一、细胞计数 细胞计数是细胞实验中的一项基本技术，在细胞转染、生长曲线测定、肿瘤细胞迁

30、移实验、肿瘤细胞侵袭实验、抗肿瘤药物的筛选等很多实验中都用到此项技术。分类分类：n细胞计数板计数法n电子细胞计数仪计数法。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（一）步骤（一）步骤1、制备细胞悬液：用胰酶消化贴壁细胞或直接收集悬浮培养的细胞制成单个细胞悬液。2、加样：用移液器吸取少许细胞悬液在计数板上盖玻片的双侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不要溢到计数板的凹槽内。加样过程中不能产生气泡。3、计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压线时本着计左不计右、计上不计下的原则准确的计数细胞。4、将计算结果代入公式得出细胞密度： 细胞数/毫升

31、原液=（4大格细胞数之和/4）104细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）注意事项（二）注意事项1、细胞悬液中的细胞一定是单个的细胞。2、在加样前一定将细胞悬液充分混匀。3、计数时，如遇上2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。细胞团的数量不应超过计数细胞的10%。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心二、细胞生长曲线二、细胞生长曲线（一）原理及应用 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。通过此实验我们除了能够得到正常组织细胞、肿瘤细胞的生长规律外，同时我们还应用于体外药物敏感性的测定以及多种抑癌基因的研究。常用方法有细

32、胞计数法和MTT法。（二）操作步骤（略）细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（三）注意事项（三）注意事项1、细胞计数法一般用24孔板，MTT法用96孔板。2、加入的细胞总数和培养基的量都要一致。3、细胞计数要准确，接种的数量要适中，以7天刚好长满为宜。不能使细胞增殖缓慢，也不能使细胞产生生长抑制。一般情况下，24孔板每孔接种1万2万，设三个副孔分别计数，取平均值；96孔板每孔接种10002000个，要设两个副孔。4、细胞计数法时，直接加1ml胰酶.5、根据时间和细胞数量的关系绘制曲线。注意：本实验有2030的误差。为了数据准确最好重复一次。细胞学相关实验细胞学相关

33、实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心三、克隆（集落）形成实验三、克隆（集落）形成实验（一）概念及应用 克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法。所谓克隆是指单个细胞在体外持续增殖6代以上其后所形成的细胞群.通过计数克隆形成率可对受检细胞的增殖潜力作定量分析。常用于抗肿瘤药物敏感性测定、基因治疗、肿瘤放射生物学等方面的研究。方法：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心克隆形成率克隆形成率% =克隆数克隆数 接种细胞数接种细胞数100细胞学相关实验细胞学相关实验（二）公式（二）公式哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（三

34、）操作方法：（三）操作方法： 1.平板法:适用于贴壁生长的细胞（细胞生长快慢均可）。具体操作如下： 将受检细胞经胰酶消化制成单个细胞悬液-细胞计数-细胞按倍数稀释接种于24孔板或6孔板中培养23周-终止培养PBS冲洗-吉姆萨液染色-计数克隆数。注意：（1）要根据细胞增殖能力设计梯度。一般每孔按50、100、200个细胞的梯度密度设计。（2）终止培养时间以不少于2周而且克隆之间不发生融合为标准。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心2.琼脂法：适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。 具体操作如下：将1.2%的琼脂与2培养基按1：1混合-6板中加1.5ml/孔成底

35、层琼脂-彻底冷凝后-用培养基配成0.35琼脂作为上层琼脂且内加细胞（200或400)-培养2周-计数克隆数。注意：（1）琼脂法所用琼脂应为低熔点琼脂。配好的琼脂要放在水中预温，下层琼脂水温在50-60度之间，上层琼脂水温不要超过42度；（2）应使下层琼脂充分凝固后,再浇上层琼脂，以避免上层琼脂培养基中的细胞进入下层琼脂中；（3）浇上层琼脂时操作要迅速，以免液体过凉导致上下分离；（4）操作中不能产生气泡。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心四、基底膜侵袭实验四、基底膜侵袭实验Transwell小室法:1. Transwell1. Transwell小室法的特点及原理

36、小室法的特点及原理 Transwell小室其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，孔径大小有0.112.0m，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜.将小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装的培养液其血清浓度较低，下室内盛装的培养液其血清浓度较高，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞的基底膜，经一定时期培养后，我们计数通过聚碳酸酯膜细胞的数量来判断受检细胞的侵袭能力。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心2.2.实验步骤：实验步骤

37、：Transwell小室的准备： 购买的小室有两种，一种是已铺好基质胶的，买来就可以用很方便，但也比较贵；另一种要自己铺胶（层黏连蛋白和型胶原 ），价格较便宜。（1）从-20冰箱中取出小室在超净台内将其放入24孔板，室温放置。（2）在24孔板和小室内各加入500L预热的无血清培养基，37孵箱中水化2h。（3）水化后，在超净台内用移液器小心地将小室液体移出，不要碰到基底膜。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（4）将受检细胞全培养基终止消化，细胞计数，将细胞稀释到10万/mL浓度备用（培养液含0.2-1%血清）。（5）在24孔板内另一排孔中加入750L全培养基（培养

38、液含10-15%血清），将小室移入上孔中，注意小室膜下不要产生气泡，如产生气泡应去除。（6）在小室内加入500L以备细胞悬液（5万个细胞/孔），每组细胞设3个复孔。吹打均匀，镜下观察。（7）37孵箱中，培养24h。（8）从24孔板中取出小室，去掉液体用棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面，去掉未发生侵袭的细胞。（9）膜在无水甲醇中固定1min，水洗2遍；苏木素染色5min，水洗干净（至无色）；伊红染色20sec，水洗干净。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（10）将膜完全晾干。（11）用手术刀将膜完整地切下，中性树胶将膜粘到载玻片上，盖上盖玻片。（12）光镜下观察

39、，计数，拍照。细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心五、细胞转染技术五、细胞转染技术（一）简述：1 1 原理：原理：是指通过不同的载体和不同的导入方法将外源基因送入细胞内，并使其在细胞内表达 。2 2 导入方法：导入方法：物理介导、化学介导和生物介导三类。物理介导有电穿孔法、显微注射和基因枪等；化学介导有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导等；生物介导最常用是病毒介导的转染技术。 细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心3 转染类型：转染类型：瞬时转染和稳定转染（1）瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上，在外源基因导入细胞1-4天后收获细胞进行分析。（2）稳定转染需要外源基因整合到细胞的染色体上，从而得到稳定的转染细胞株。 细胞学相关实验细胞学相关实验哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心（二）细胞转染的注意事项：