丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备

1、项目三、丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备任务1 SHMT电泳制备方案的制定及实训准备 指导老师：彭加平、韦平和 班级：生物制药1213 制作人：孙玉桃 学号：2012040722目录2.聚丙烯酰胺凝胶电泳简介4.实训原料、仪器和试剂1.实训基础知识3.实训原理5.实训步骤6.注意事项实训基础知识丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）在自然界中普遍存在，它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。SHMT的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点，在氨基酸的工业生产和植物的光呼吸过程中，SHMT也是一个关键酶。L-丝氨酸在体内代谢速度极快，因此，直接发酵生产很困难。酶法合成L-丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异

2、的合成L-丝氨酸，具有原料来源方便，原料成本低和可合成高浓度产品等优点，因此是最有前景的L-丝氨酸生产方法。实训基础知识电泳是指带点颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分许，也可用于混合物的分离。凝胶电泳用于其操作简单、快捷、灵敏等优点，已成为蛋白质、核算研究的首选标准方法。电泳技术的分类粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳凝胶电泳，如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳滤纸及其他纤维素膜电泳按支持物物理性状分类 电泳技术的分类垂直板式电泳连续式流动电泳平板式电泳按支持物的装置形式不同分类 电泳技术的分类不连续p

3、H电泳连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变滤纸及其他纤维素膜电泳按pH的连续性不同分类 凝胶电泳技术几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚焦，最常用的就SDS-PAGE电泳技术。SDS-PAGE电泳可用圆盘和垂直平板电泳的形式，原理相同，步骤也大致相同。SDS-PAGE电泳可分为不连续系统和连续系统。本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS-PAGE方式进行电泳。垂直平板电泳的有点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比较。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryla

4、mide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶由聚丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N,N-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N,N-methylene-bis-acrylamide，简称Bis）聚合而成。PAGE电泳是根据蛋白分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗透作用，设备简单，用样量少（1-100ug）和分辨率高等优点，并可通过可控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等

5、物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基分子量。实训原理1.带点质点电场中向所带异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。2.蛋白质分子是两性电解质，pHpI时该蛋白质带负电荷，反之pHpI时该蛋白质带正电荷。实训原理3.SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特性的负离子团块，从而

6、降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的速率取决于分子大小。当蛋白质的分子量在1500200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr=K-bmR式中：Mr为蛋白质的分子量，K为常数，b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。实训原理5.聚丙烯酰胺的作用：聚丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与

7、否，与促凝剂及环境密切相关；6.TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；AP中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺，能产生自由氧基，使聚丙烯酰胺聚合。7.SDS:阳离子去污剂，作用有：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白质分子内的疏水作用、去多肽折叠。实训原理实训原料、仪器和试剂垂直板型电泳槽、天平、直流稳压电源、50或100ul微量注射器、玻璃板、水浴锅、染色槽、烧杯、吸量管、常头滴管等。SHMT标准蛋白质按照每种蛋白0.51mg/mL样品溶解配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。实训原料实训仪器实训试剂1.分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液pH8

8、.9）：取1mol/LHCl 48mL，Tris 36.3g，用无离子水溶解后定容至100mL。2.浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液pH6.7）:取1mol/LHCl 48mL，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL。3. 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中，4保存4.10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。实训试剂5.10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用

9、前微热，使其完全溶解。6. 1%TEMED7. 10%过硫酸铵（AP）:现用现配8. 10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。9.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液pH8.3）：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，用无离子水溶解后定容至1L。实训试剂9.样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。10.染色液：0.25g考马斯亮

10、蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。11.脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。实训步骤电泳是指带点颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分许，也可用于混合物的分离。凝胶电泳用于其操作简单、快捷、灵敏等优点，已成为蛋白质、核算研究的首选标准方法。实训步骤装上贮槽和固定螺丝钉，仰放在桌面上。将长、短玻璃板分别插到硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触灌胶面的玻璃。1.1.安装夹心式垂直板电泳槽：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥安装夹心式垂直板电泳槽：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥将已插好玻璃板

11、的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板面对上贮槽。将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽，在长玻璃板下端竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的融化的1%1%琼脂，以封住空隙，加琼脂，以封住空隙，加琼脂溶液时，应防止气泡进入。琼脂溶液时，应防止气泡进入。实训步骤2.配胶SDS不连续体系凝胶的制备实训步骤4.样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴恒中加入1min，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为

12、10-15ul（即2-10ug蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。5.电泳。将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶时，将电流调回到零，关闭电源拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。6.染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区清晰，即用直尺分别量取个条带与凝胶端的距离。（1）分离胶制备：按表配制20mL 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至

13、长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1mL注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3-4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。浓缩胶的制备：按表配制10mL 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20-30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。实训步骤3.制备凝胶板制备凝胶板注意事项1.安装电泳槽时注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。2.用琼脂糖底部及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。3.样品中应含有一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被