凡纳滨对虾胚胎发育的时序及特征研究解析

1、凡纳滨对虾胚胎发育的时序及特征研究0、引言【研究意义】凡纳滨对虾（Litopenaeus vanname）又名南美白对虾，是迄今世界 养殖产量最高的优良虾种，因其具有壳薄体肥、肉质鲜嫩、生长迅速、群体生长 均匀、抗病力强等优点，深受国内外市场的青睐（林琼武等，2006； Aloise etal.，2011;彭金霞等,2013）。开展繁殖生物学研究、完善苗种培育技术及制定人工育苗标准化操作规范，是实 现凡纳滨对虾人工规模化繁育的有效途径；而确立不同温度下受精卵第一、第二 极体释放时间，是开展凡纳滨对虾雌核发育诱导及后续细胞工程育种研究的重要 基础。因此，有必要深入开展凡纳滨对虾的胚胎发育生物学研

2、究。【前人研究进 展】随着国内外对虾增养殖业的迅猛发展，以提升养殖产量和品质为主要目标的 染色体组工程已成为对虾育种研究的重点领域（Garnica-Rivera et al.， 2004；Sellars et al，2010； Aloise et al.，2011）。目前，有关对虾胚胎及幼体发育的研 究集中在形态描述（Garc a-guerrero and Hendrickx 2009;栗治国等，2013），且发现水温变化是 对虾繁殖和生长发育的关键因素（彭昌迪等，2002），在生长、存活、生理生化和能量代谢等方面均已得到证实（ChenandLai，1993； Wyban et al，1995

3、； Kumlu et al.，1995；李庭古等，2006）。国 内已有学者对红螯螯虾、凡纳滨对虾、克氏原螯虾和脊尾白虾等的胚胎发育过程 进行了观察和描述（孟凡丽等，2000；彭昌迪等，2002;吕建林等，2006；栗治 国等，2013）；国外学者则主要针对罗氏沼虾和长臂虾科4种对虾的胚胎发育进程及发育形态特征进行观察（Mu ller et al.，2004； Garca-guerrero andHendrickx 2009）。有关对虾雌核发育的研究国内外鲜见报道，仅见国内学者在20世纪90年代进行了一些试验性尝试（戴继勋等，1993；蔡难儿等，1995；陈本楠等， 1997），但至今未获得对

4、虾雌核发育诱导技术的突破。【本研究切入点】凡纳滨 对虾卵子染色体加倍是雌核发育诱导的两大技术之一，而受精卵极体释放时间又 是染色体加倍成功与否的关键，目前在国外虽有相关研究报道（Garnica-Rivera et al.，2004； Aloiseet al.，2011），但因品种和环境条件差异而尚无定论。【拟解 决的关键问题】以广西水产科学研究院选育获得并拥有自主知识产权的国审水产 新品种（登记号GS-01-001-2012）凡纳滨对虾 桂海1号”为研究对象，对该品种不同温度下受精卵发育时序进行观察，旨在了解凡纳滨对虾胚胎发育的时 序及特征，尤其是第一极体和第二极体排出的时间点，为其雌核发育诱

5、导中染色体加倍最佳操作窗口的确定及人 工苗种生产提供参考依据。1、材料与方法1. 1亲本来源及孵化用水处理雌雄亲虾为广西水产科学研究院国家级 SPF南美白对虾良种场车间内人工培育至 性腺成熟的桂海1号，其中，雌虾体重60.471.79 g,体长20.270.64 cm；雄 虾体重44.132.02 g,体长18.000.53 cm。自然海水经暗沉淀、砂滤，双层棉 滤袋过滤两次后再用滤器过滤 3次，并以甲醛和优乐碘分别杀菌，EDTA钠盐螯 合重金属离子（彭昌迪等，2002）。1.2胚胎发育观察从雌虾池中挑选已成功交配贴荚的雌虾（背部暗红色性腺线条连续且清晰），臵 于500 L的玻璃圆桶内待产卵，

6、水温控制在（30.00.5）C，盐度28.6%。，避 光，不充气，产卵后移走亲虾，并及时采集受精卵进行连续显微观察。具体操 作：先在直径4 cm的细胞培养级平皿中用微吸管或枪头吸取1滴经净化消毒灭菌的海水（20.0 QL,保持液滴在平皿中不扩散，呈球形液滴，然后吸取细胞培养 级矿物油将该海水液滴完全覆盖，使海水液滴完全包裹于矿物油中，防止挥发扩 散。在解剖镜或光学显微镜下，用玻璃毛细管小心挑选吸出3枚正常的受精卵，将其小心移入海水液滴中，随后调整物镜，并设 臵拍照时间进行连续拍照，中途无需添加海水，但需定时观察确认显微镜物镜镜 头是否正位，如移位则进行微调（孟凡丽等， 2000）。1.3不同水

7、温下的受精卵孵化试验将成功交配的雌虾每尾单独臵于室内500 L的玻璃圆桶内，水温控制在（30.00.5）C，促其产卵，试验用水为净化处理的洁净海水，盐度26.0 %29.0 % pH8.18.5。当观察到雌虾产卵后，从桶内随机收集50枚受精卵，分别转入以水浴控温在28.0、29.0、29.5、30.0和30.5 C的500 mL玻璃烧杯中孵化，每个温度梯 度重复3次。期间定时轻轻搅动水体，使卵子均匀悬浮分布，观察不同水温梯度 受精卵的孵化情况（彭昌迪等，2002;林琼武等，2006）。1.4统计分析以Excel 2003和SPSS 17.0软件处理试验数据，并采用 Dun can单因素方差分析

8、 法进行显著性分析。2、结果与分析2. 1凡纳滨对虾胚胎发育时序及形态特征凡纳滨对虾受精卵在水温30.5 C、盐度28.6 %。的条件下，经过11.511.8 h完成 孵化，幼体陆续破膜而出，其胚胎发育过程详见表1。凡纳滨对虾的发育属于直接发育类型，体外受精，体外发育，整个胚胎发育都在卵膜内进行。根据胚胎发 育的形态特征变化，可分为7个阶段：受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、肢 芽期、膜内无节幼体期和出膜幼体期。（1）受精卵期：成熟卵子为橙黄色，呈发散状从生殖孔排出，产出瞬间为游离 态，但粘性很大，接触海水不久便聚集成团，且具沉性；卵子发生皮层反应，皮 层中的周边体向外扩散，卵子逐渐由不规则变

9、为圆形。周边体完全溶解消失后， 围卵膜开始突起，瞬间卵子完成第一次成熟分裂，排出第一极体；随同围卵膜举 起，1 min后即完成第二次成熟分裂而排出第二极体。（2）卵裂期：卵子受精后的卵裂方式为完全卵裂，且有螺旋型卵裂的卵子在受精1.02.0 h就开始卵裂，先由1个细胞分裂成两个细胞，再由两个细胞分裂成4个细胞，以后按几何级数递增。（3）囊胚期：当胚胎发育至32-细胞时，呈圆球形囊胚，植物极的分裂比动物极 慢。（4）原肠期：以内陷方式形成原肠，至 64-细胞末期，两个内胚层母细胞内陷入囊胚中，不久中胚层细胞也出现在囊胚腔中。至128-细胞期内陷更明显，背唇外作用最快，胚孔近似三角形，在受精后 1

10、0.0 h左右形成原肠，胚孔闭合。（5）肢芽期：胚胎依次出现第二触角原基、大颚原基及第一触角原基，此时的 胚胎可观察到3对原基隆起。（6）膜内无节幼体期：肢芽分化出内外肢，肢端生出刚毛，胚体前端腹面中央 出现红色眼点，胚体在卵膜内逐渐转动，不久幼体破膜孵出。（7） 出膜幼体期：历时11.511.8 h,在胚体后期发育中卵黄大量损耗，卵黄囊 大幅度缩小，孵化时大部分卵黄被吸收；幼体在膜内急剧运动，以身体附生刺和 刚毛刺破卵膜，尾部在卵膜最薄处破膜而出，甩掉卵膜进入水中，成为自由生活 的无节幼体。出膜后的幼体还含有卵黄囊，出膜32.0 h后幼体开始开口摄食。 2. 2不同温度下凡纳滨对虾的胚胎发育

11、进程由表2可知，水温变化对受精卵极体的排出和孵化时间有明显影响，水温为 28.030.5 C时，受精卵的发育速度随水温升高而变快，当水温由28.0 C上升至30.5 C时，孵化时间从13.0 h缩短至11.5 h,即水温每升高1.0 C,孵化时间就 缩短0.6 h。水温为28.030.5 C时，凡纳滨对虾受精卵第一极体释放时间为 7.013.0mi n,第二极体释放时间为 8.014.0 mi n。車 I L叩氏 h f I q i J 11 .匕巴R WIi rriii p I . i i #iuu! i r *| u it !| iri. t E.|ii I uili rB h 厂軋 JS

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13、lii il.l-ll t4utuIkI ft Mil A3、讨论彭昌迪等（2002）以人工培育成熟的凡纳滨对虾为材料，观察并描述胚胎发育过 程，发现在水温29.5 C、盐度28%。的条件下，从其卵子产出受精至孵化过程可 分为卵裂、原肠胚、肢芽期和膜内幼体等 4个阶段，整个胚胎发育过程需12 h左 右。本研究观察发现，凡纳滨对虾的受精卵呈豆绿色，直径0.280.30 mm,其发育属于直接发育类型，体外受精，体外发育，整个胚胎发育都在卵膜内进行；根 据胚胎发育的形态特征变化（孟凡丽等，2000;吕建林等，2006），可分为7个 阶段：受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、n- 2F ig. 2 Dv

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15、* 电畳鼻 1|4吟jf in 尸建1 乙*肢芽期、膜内无节幼体期和出膜幼体期，与彭昌迪等（2002）的研究结果基本一致。 凡纳滨对虾属变温动物，水温高低决定其新陈代谢的速度，同样胚胎发育速度也 直接受水温影响。彭昌迪等（2002）报道不同水温对凡纳滨对虾受精卵孵化出膜 的时间有显著影响，水温从 29.5 C下降至26.8 C,孵化时间从11.3 h增加到 15.0 h;最适孵化水温为28.030.0 C；在水温29.5 C、盐度28%。的条件下其受 精卵第一、二极体释放时间分别为7和8 min。栗治国等（2013）报道，在19.031.0 C的水温范围内脊尾白虾受精卵均可正常发育孵化出幼体，

16、且高温可明 显加快胚胎发育速率，缩短各期胚胎发育持续时间。由于研究方法和对虾品种的 差异，本研究结果与彭昌迪等（2002）、栗治国等（2013）的研究结果有所不 同，但所表现出的变化趋势基本一致，当水温由30.5 C下降至28.0 C，孵化时间从11.5 h增至13.0 h,即水温每下降1.0 C,孵化时间需增加0.6 h;在 28.030.5 C的水温范围内，凡纳滨对虾受精卵第一极体释放时间为713mi n,第二极体释放时间为814 min,胚胎发育需11.513.0 h。可见，在确保受精卵正常 发育的前提下，适当调低培育水温能延迟胚胎发育速度，为人工诱导卵染色体加 倍创造较充足的操作窗口期

17、。本研究观察发现有部分发育异常的受精卵，可能由于操作机械损伤或卵过于集中 缺氧等，而导致受精卵破裂溶解或停滞发育在多细胞期、肢芽期、膜内幼体期等 胚胎发育阶段。此外，本研究还发现未受精卵发生皮层反应后发生卵裂行为，但 形成的分裂球大小不等、形状各异，且到达相同分裂期所需的时间比受精卵延迟 很多。如水温为29.030.0 C时，正常受精卵分裂至2-细胞需2530 min,而未受 精卵需1.52.0 h0一般情况下，受精卵是进行正常的完全均等卵裂行为，分裂球界限分明，而未受 精卵通常在完成第二次卵裂后即停止发育，且分裂球界限模糊不清。因此，受精卵是否正常进行完全均等分裂是确定卵子受精与否的重要标准

18、(彭昌迪等，2002； Garnica-Rivera et al.，2004)。该结论为后续判定灭活精子是否成功激活卵 子并成功加倍为雌核发育二倍体提供了标准，发育至 2-细胞期仍能继续正常发育 的受精卵即为成功诱导的雌核发育二倍体受精卵。4、结论本研究结果表明，在确保凡纳滨对虾受精卵正常发育的前提下，适当调低培育水 温能延迟胚胎发育速度，为人工诱导卵染色体加倍创造较充足的操作窗口期。此 外，受精卵是否均等分裂是判断凡纳滨对虾卵子受精与否的重要标准。参考文献：1. 蔡难儿，林峰，柯亚夫，陈本楠.1995.中国对虾人工诱导雌核发育的研究I 四步诱导法J.海洋科学，(3): 35-41.2. 陈本楠，蔡难儿，李光友.1997.中国对虾人工诱导雌核发育的研究II.紫外线辐 射对精子顶体反应和受精能力的影响J.海