实验一——鸡胚成纤维细胞的培养

1、第一讲第一讲 鸡胚成纤维单层细胞的制备鸡胚成纤维单层细胞的制备与培养与培养预防兽医微生物组预防兽医微生物组实验目的1.1.掌握无菌操作技术掌握无菌操作技术2.2.掌握细胞培养所需的仪器、设备掌握细胞培养所需的仪器、设备 3.3.了解细胞培养的相关理论了解细胞培养的相关理论4.4.掌握鸡胚成纤维细胞的原代培养技术掌握鸡胚成纤维细胞的原代培养技术实验背景实验背景 原代细胞培养因具有细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用于病毒学、细胞分化、药物测试等试验。在禽类原代细胞培养中，鸡胚成纤维细胞(chickenembryo fibroblast，CEF)得到

2、普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下，在体外模拟体内生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。与其他细胞相比，CEF相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化，所以被广泛地应用于分子和细胞生物学研究，以及疫苗的生产。实验材料l预加预加10%FCS和双抗的和双抗的1640培养液；培养液；消化液消化液(0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液溶液)；D-Hanks平衡盐溶液；平衡盐溶液；l灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个；个；l巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊巴

3、氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪把，剪刀刀1把；把；l碘酒，碘酒，75酒精棉球；酒精灯酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。台；废液缸。实验设备实验设备（1） 37-CO2培养箱培养箱（2）倒置显微镜）倒置显微镜（3）超净台）超净台实验步骤 1.取胚取胚 选择选择9-11日龄鸡胚日龄鸡胚于蛋架上，先后用碘酒和于蛋架上，先后用碘酒和75%酒精消毒酒精消毒气室部外壳气室部外壳。用无菌眼科镊子击破该部用无菌眼科镊子击破该部位的蛋壳和卵膜，撕破尿位的蛋壳和卵膜，撕破尿囊膜和羊膜，并轻轻囊膜和羊膜，并轻轻夹住夹住鸡胚颈部鸡胚颈部取出鸡胚，放入取出鸡胚，放入无菌平皿中。无菌平皿中。 1气室气室 2卵壳卵壳

4、3卵黄囊卵黄囊 4卵白卵白 5 尿囊腔尿囊腔 6绒毛尿囊绒毛尿囊 7胚胎胚胎 8羊水腔羊水腔 9胚胎外腔胚胎外腔 2. 剪碎剪碎 用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内脏，留下躯干组织。用脏，留下躯干组织。用D-HanksD-Hanks液冲洗，除去血液后液冲洗，除去血液后移入灭菌青瓶中，用灭菌剪刀尽量剪碎（移入灭菌青瓶中，用灭菌剪刀尽量剪碎（1mm1mm3 3小块），小块），再再用用D-HanksD-Hanks冲洗冲洗2 2次直至组织发白为止，然后将洗液次直至组织发白为止，然后将洗液上清吸弃。上清吸弃。 3.酶消化酶消化 根据鸡胚组织块的多少，加入大约根据

5、鸡胚组织块的多少，加入大约4 4倍量的倍量的胰酶胰酶(5-6mL)(5-6mL)，于，于3737温箱内消化温箱内消化15-20min15-20min，视其组，视其组织碎块变松散（织碎块变松散（聚合成一团、边缘毛样模糊聚合成一团、边缘毛样模糊）即可）即可。轻轻吸出消化液，用轻轻吸出消化液，用D-HanksD-Hanks洗洗1-31-3次。次。 4.吹打吹打 加适量加适量16401640营养液，用巴氏吸管反复吹吸数次，营养液，用巴氏吸管反复吹吸数次，使细胞分散，制成细胞悬液。静置使细胞分散，制成细胞悬液。静置1 1分钟，使未冲散分钟，使未冲散的组织块沉淀，吸出细胞悬液于的组织块沉淀，吸出细胞悬液于

6、20mL 20mL 营养液中。重营养液中。重复复3 3次收集细胞悬液，直至鸡胚发白为止。次收集细胞悬液，直至鸡胚发白为止。 将纱布置于细胞瓶口，用吸管吸取细胞悬液滤过至细将纱布置于细胞瓶口，用吸管吸取细胞悬液滤过至细胞瓶中（注意不要将悬液溢出）。胞瓶中（注意不要将悬液溢出）。 5.培养培养 于于37-CO37-CO2 2温箱内培养。温箱内培养。24-48h24-48h后可长成单层后可长成单层细胞。细胞。实验结果实验结果1、观察原代细胞的形态和生长状况；、观察原代细胞的形态和生长状况；2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细菌污染。菌污染。注意事项注意事

7、项 1. 切割组织块时务必要切成小块切割组织块时务必要切成小块2. 整个操作过程要严格保持无菌整个操作过程要严格保持无菌3.严格控制胰酶消化时间严格控制胰酶消化时间 4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期和放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期和组别组别 5. 实验用品放回原处，摆放整齐实验用品放回原处，摆放整齐无菌操作的一般要求l用用75酒精擦拭消毒双手。酒精擦拭消毒双手。l超净台台面应整洁，用超净台台面应整洁，用0.1新洁尔灭擦净。新洁尔灭擦净。l打开超净台的紫外灯照射台面打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用左右。使用超净台时，打开风机，点燃酒精灯。超净台时，打开风

8、机，点燃酒精灯。l严格在酒精灯无菌范围之内操作。严格在酒精灯无菌范围之内操作。l使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌端安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水瓶或试管内。盐水瓶或试管内。l操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。品，如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 l不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。部。l拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低倒液体前后都要灼烧