核酸适体结构转换荧光法检测黄曲霉毒素B1

1、核酸适体结构转换荧光法检测黄曲霉毒素B1班珺1,2, 3谢岩黎1,2*(河南工业大学粮油食品学院1,郑州450052)(河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室2，郑州450052)(广西崇左市食品药品监督管理局/崇左市食品药品检验所3，崇左532200)摘要基于黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1, AFB1)与互补链竞争结合核酸适体的位点使荧光恢复，建立了核酸适体结构转换荧光法检测AFB1。以PBS为工作液，200nmol/L核酸适体与200nmol/L猝灭链反应30min后加入AFB1孵育1h，利用荧光分光光度计检测到的荧光恢复程度对AFB1进行定量检测，可获得该方法的最佳效果。在优

2、化条件下，AFB1检测浓度范围为1300ng/mL，检出限为0.8ng/mL。对该检测方法的特异性进行考察， 结果表明该法具有良好的特异性。对花生、玉米实际样品进行检测，回收率在81.1%- 108.3%之间。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔朧。关键词核酸适体曲霉毒素B1荧光检测中图分类号：TS207.3文献标志码：AAn Aptamer StrutureCo nversion Fluoresce nee Assay for the Detection of Aflatox in B1聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測樅。BAN Jun 1,2, 3XIEYa nli1,2*(College of Food S

3、eienee and Technology, Henan University of TechnoIogy1, Zhengzhou 450052)残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骤東。(He nan Key Laboratory of Cereal and Oil Food Safety In spection and Con trol2, Zhe ngzhou 450052)酽锕极額閉镇桧猪訣 锥顧荭钯。(Food and Drug Admini strati on of Chon gzuo, Guan gxi/ Chon gzuo In stitute for Food and Drug Con t

4、rol3, Cho ngzuo532200)彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔肤。AbstractA n aptamer struture conversion fluoresce nee assay for the detecti on of Aflatox in B1 was developed based on AFB1competed withcompleme ntary olig onu cleotides to bind to aptamer that cause fluoresce nee recover. AFB1was detected by fluoresce nee spectro

5、photometer through the fluoresce nee recovery phe nomenon as follow condition: PBS as the working buffer, after 200 nmol/L aptamer reacted with 200 nmol/L quenching oligonucleotide for 30min, addi ng AFB1 in the detect ion system and in cubated for 1h. Un der the optimum con diti ons, the lin ear ra

6、nge for theAFB1concentration detection is 1-300 ng/mL witha detection limit of 0.8 ng/mL.The specificity of the method was in vestigated and the result showed that was good.Tak ing pea nut and corn as samples for recovery test, the recovery rate was between 81.1% 108.3%.謀养抟箧飆鐸怼类蒋薔點鉍杂。Keywordsaptamer

7、,aflatox in B1,fluoresce nce,detect ion 厦礴恳蹒骈時盡继價骚卺癩龔。黄曲霉毒素是由黄曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等产生的一类含有二氢呋喃环结构的次生代谢产物1,2。在已分离出的20余种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1, AFB1)致癌性最强，被认为是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要因素之一 3。为保障食品安全及人类健康，GB 2761-20XX4对我国食品中AFB1的限量规定为：花生、玉米及其制品20卩g/k,稻谷、糙米、大米、植物油脂 10卩g/kg谷物类、豆类、坚果类、

8、酿造调味品 5卩g/kg长期以来，科研工作者为AFB1的检测探索了许多方法，常见的传统方法有薄层色谱法5、高效液相色谱法6、液质联用法7、酶联免疫吸附法8等，新兴的检测方法有电化学免疫传感器9、化学发光免疫法10、太赫兹光谱法11、核酸适体法12等，这些方法的产生极大 丰富了 AFB1的检测。当前针对 AFB1的检测方法众多，每种方法各有其优缺点，仪器检测法灵敏度高、结果 较为可靠，但所需仪器昂贵、前处理复杂繁琐，不便于大批量检测；免疫学法检测速度快、操作简单，但所 用的抗体制备成本高，保存条件苛刻，批间质量不一，易出现假阳性。因此，开发高效、便捷、灵敏的检测基金项目：河南省科技厅科技攻关项目

9、(162102310084);郑州市科技局新兴产业研究计划项目(20XX0503)收稿日期：2018-04-02作者简介：班珺，女，1992年岀生，硕士，食品安全检测技术通信作者：谢岩黎，女，1971年岀生，教授，食品营养与安全方法成为当务之急。 茕桢广鳓鯡选块网羈泪镀齐鈞。核酸适体（Nucleic acid aptamer）是采用指数富集配体系统进化技术（ SELEX从体外人工合成的单链核酸文 库中筛选出能与靶物质高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸片段13, 14 。核酸适体因其靶物质范围广、亲和力高、特异性强等特点， 在毒素 15-18 、蛋白19-22 、激素 23-25 、农药26-28

10、 、金属离子 29-31 、细胞 32-35 等的检测领域成为重要工具。目前，基于核酸适体的 AFB1 检测方法，如纳米金法 36 、化学发光法 37、电 化学法 38 等相继报道。 鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴縈诘聾。本研究根据核酸适体结构转换信号检测靶分子的原理 39,40 ，将标记有羧基荧光素 （ Carboxy Fluorescein, FAM）的AFB1核酸适体与标记猝灭基团（ Black Hole Quencher 1, BHQ1）的AFB1核酸适体互补链配对杂交，通过AFB1 竞争结合核酸适体的位点使荧光恢复，建立了基于核酸适体结构转换荧光法检测AFB1 的方法。 籟丛妈羥为贍偾蛏练淨槠

11、挞曉。材料与方法1.1 仪器与试剂Cary Eclopse荧光分光光度计（美国VARIAN公司），实验测定参数：激发波长490nm，发射波长505 nm - 600nm , 激发狭缝10nm，发射狭缝10nm。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴買闥龅。黄曲霉毒素 B1（AFB1）、赭曲霉毒素 A （OTA）、雪腐镰刀菌烯醇（DON）标准品（SigmaAldrich公司）；玉米赤霉烯酮（ZEN标准品（北京普天同创生物科技有限公司）；Na2HPO4?12H2O、KH2PO4 NaCI、KC、MgCI2、CaCI2、HCI、三羟甲基氨基甲烷等（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。实验用水均为纯净水（杭州娃哈哈

12、集团有限公司） 。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦鋇絨钞。实验所用AFB1核酸适体及其互补链均由上海生工生物工程有限公司合成并经HPLC纯化，序列如下：核酸适体 1 : 5-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC灭链 1: 5 -ACACGTGCCCAAC-BHQ1 -BHQ1-TGTGGGCCTAGCG。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡缝勵罴。-3 ； 核 酸 适 体 2：5-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTCACGCGGACA-FAM -3 ； 猝 灭 链 2 ：51.2 实验方法1.2.1 荧光基团标记位置及工作液的选

13、择以PBS为工作液，比较FAM荧光基团标记核酸适体不同端位对荧光恢复情况的影响，选择荧光恢复率最佳的核酸适体链，以 Tris-HCl 为工作液测定检测系统的荧光恢复率，比较不同工作液对荧光恢复情况的影响。通 过（F-F0）/F0求荧光增长率，其中F0为猝灭状态时的荧光强度，F为加入毒素后的荧光强度。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷報赢无。1.2.2 猝灭链浓度的选择用工作液将 BHQ1 标记的猝灭链配制成 100、120、140、160、180、200、220、240nmol/L ,分别与 200nmol/LFAM 标记核酸适体反应 30min 并测定其荧光强度，观察不同浓度互补链对核酸适体荧光基团的猝灭

14、程度。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷鯛汉鼉。1.2.3 反应时间的优化将 200nmol/L 核酸适体与猝灭链反应 30min 后，向反应体系加入 50ng/mL AFB1 并记录其加入反应体系 10、 20、 40、 60、 80、 120min 后的荧光强度，选择最适反应时间。 坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚跻馱釣。1.2.4 AFB1 的定量检测用PBS缓冲液将核酸适体 2、猝灭链2配制成200nmol/L ,将AFB1母液稀释成0、0.1、1、10、50、100、200、 300ng/mL ,在优化好的检测体系中进行标准曲线的建立。400卩L 200nmol/L核酸适体2与400卩L 200nmol/L猝

15、灭链2反应30min后，将800 L一系列不同浓度的 AFB1标准液加入反应体系，充分反应1h后测定其荧光强度，以 AFB1 浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标建立荧光法检测 AFB1 的标准曲线。 蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘籜葦繯。1.2.5 方法特异性考察将赭曲霉毒素 A （OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、雪腐镰刀菌烯醇（DON）配制成100ng/mL。以PBS作为工作 液，将200nmol/L核酸适体2与200nmol/L猝灭链2反应30min ,分别向反应体系中加入 100ng/mL OTA、ZEN DON,平衡孵育1h后采用荧光分光光度计测定荧光强度。通过（F-F0）/F0对该检测方法的特异

16、性进行分析， 其中F0为猝灭状态时的荧光强度，F为加入毒素后的荧光强度。買鯛鴯譖昙膚遙闫撷凄届嬌擻。126样品测定将花生、玉米粉碎，过20目筛，称取5 g样品，以20 mL乙腈-水（85:15）为提取液高速均质 5 min ,4000 r/min 高速离心5 min后取4 mL上清液，氮吹仪吹干提取液，加入1mL PBS工作液复溶，采用优化好的检测方法测定样品的初始浓度 C0。回收实验中，向样品加入不同量的AFB1,使样品含AFB1分别为5、20、60卩g/kg采用优化好的检测方法检测加标后的检测浓度C1，以（C1-C0）/加标浓度计算回收率。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴飙铳麦。结果与讨论2.1实验原

17、理检测原理如图1所示，AFB1竞争结合核酸适体的位点，导致猝灭基团标记的核酸互补链脱落，核酸适体构象发生改变，检测体系荧光恢复，根据荧光强度变化对AFB1进行定量检测。检测系统初始状态为标记荧光基团（FAM）的AFB1核酸适体与标记猝灭基团（BHQ1）的互补链通过碱基互补配对结合，由于二者之间距离 很近，导致FAM被BHQ1猝灭，检测体系处于弱荧光的猝灭状态。当待测物中含AFB1, AFB1将与核酸适体发生特异性结合，核酸适体结构的改变迫使互补链从核酸适体上脱落，使荧光基团与猝灭基团的距离变远， 检测体系中荧光强度得以恢复。当待测物中无AFB1存在时，核酸适体结构不发生变化，荧光强度维持初始的

18、猝灭状态。 驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦諑琼针。图1AFB1检测原理示意图2.2荧光基团标记位置及工作液的选择实验对FAM荧光基团标记核酸适体端位及反应体系的工作液进行了研究。核酸适体1为5端标记FAM的寡核苷酸序列，核酸适体 2为3端标记FAM的寡核苷酸序列。图 2为等浓度核酸适体 1、核酸适体2于不同工 作液中的荧光强度比较，图3为核酸适体1、核酸适体2在猝灭状态加入 AFB1后的荧光增长率。由图 2、图3比较可知，工作液为PBS时，等浓度的核酸适体2荧光强度高于核酸适体1，造成该结果的原因可能为核酸适体5末端的鸟嘌呤对 FAM荧光基团产生了一定的猝灭作用，荧光强度较标记在3端序列的荧光强度弱。当

19、加入猝灭链使 FAM猝灭80%后加入50ng/mL AFB1，核酸适体2的荧光增长率（60.08%）明显高于核酸适 体1的荧光增长率（17.82%）,该结果表明FAM标记在3端的核酸适体较标记在 5端的核酸适体更有利于与 AFB1结合，这与核酸适体自身形成的空间位阻及AFB1有效识别区域有关。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑献鵬缩。以核酸适体2进一步研究工作液对荧光强度的影响，由图2可知，等浓度核酸适体下，以PBS为工作液的荧光强度略高于以 Tris-HCI为工作液的荧光强度，当加入猝灭链使 FAM均猝灭80%后加入50ng/mL AFB1，以PBS 为工作液的核酸适体荧光增长率（60.08%）高于以Tr

20、is-HCl为工作液的荧光增长率（30.58%）（图3）。上述结果表明以PBS为工作液更有利于 FAM的荧光发生，也更有利于AFB1与核酸适体的结合。综合考虑，选择核酸适体2并以PBS为工作液进行后续实验探究。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔嗚訝摈。60O.3(=二言岂15核確适体1TPBS 腰靈适体2于PBS檢醒适体仝于Trim-HCl0.00樓战适体1于PBS 様鹽适体2于PBS機蠻适体于Tris-HCl图2200nmol/L核酸适体1与核酸适体2于不同工作液中的荧光比较图3猝灭状态下加入 50ng/mL AFB1后的荧光增长率構氽頑黉碩饨荠龈话骛門戲鷯。2.3猝灭链浓度的选择向 200nmol/L

21、核酸适体 2 中加入一系列浓度（0、100、120、140、160、180、200、220、240nmol/L ）猝灭链2，充分反应30min后测定荧光强度如图 4所示。猝灭链在100nmol/L至200nmol/L时，随着浓度的增加，反 应体系中荧光强度迅速降低，当猝灭链浓度为200nmol/L时，反应体系中的荧光强度已被猝灭80%,继续加大猝灭链浓度，反应体系的荧光强度仍呈减弱状态，但变化趋势向缓。为防止猝灭链浓度过大对AFB1竞争核酸适体的结合位点造成影响，实验最终选择200nmol/L作为猝灭链最适浓度进行后续研究。輒峄陽檉簖疖網儂號泶蛴镧釃。图4猝灭链浓度的优化2.4反应时间的优化2

22、00nmol/L核酸适体2与200nmol/L猝灭链2反应30min后，向反应体系加入 50ng/mL AFB1，图5为AFB1 加入反应体系后的10、20、40、60、80、120min后的荧光强度。由图看出，在AFB1加入后的10至60min，荧光强度迅速增强，说明随着反应时间的增加，AFB1与核酸适体结合越充分，FAM与BHQ1之间的距离变得越远，荧光强度越强。AFB1加入60min后，荧光强度较 60min时略微增强但程度趋缓，从检测效率的角度考虑，最终选择 60min为AFB1与核酸适体最适反应时间。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅瀝纰縭。时间(min)图5反应时间的优化2.5AFB1的定量检测

23、在优化好的检测体系中对一系列浓度AFB1进行检测，图6为0、0.1、1、10、50、100、200、300ng/mL AFB1加入反应体系后的荧光光谱图。由图 7可知，随着 AFB1浓度的增加，FAM与BHQ1距离变远，反应体系由 猝灭状态开始恢复荧光， AFB1浓度越大，荧光强度越强。结果表明，AFB1在1300ng/mL浓度范围内与反应体系荧光强度具有良好的线性关系，线性方程为Y 0.7599X+148.9283 ( R2=0.9960),以空白样品均值的32.6特异性为考察本方法的特异性，选择粮食中常见的几种毒素：赭曲霉毒素A ( OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐镰刀菌烯醇(DON

24、)，将它们配制成100ng/mL并运用本文建立的 AFB1检测方法对其进行检测。 实验结果如图8所示，在反应系统中分别加入100ng/mL DON、OTA ZEN后，荧光增长率分别为 0.20%、3.29%、12.68%，与反应猝灭状态时的荧光强度接近，而AFB1在100ng/mL时的荧光增长率为 90.44%，远远高于其他毒素，说明实验所选用的核酸适体对AFB1具有极强的识别选择性，本文建立的AFB1检测方法特异性较强。凍鈹鋨劳臘错痫婦胫籴铍賄鹗。1.0 r8 6 4a a aQurAAUF-0.20.0AFB1DONOTAZEN不同种类生物毒素 （100ng/mL）图8方法选择性考察2.7

25、回收率以花生、玉米为样本向其中添加AFB1标准品，使浓度分别为5、20、60卩g/kg,采用本文建立的方法进行检测，实验结果如表 1所示，花生中的 AFB1回收率为95.4%108.0%之间，玉米中的 AFB1回收率为77.7% 84.7%之间，效果良好。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦聰櫻郐。表1实际样品的测定样品加标浓度（卩g/kg实测浓度(C1-C0)(a g/kg)回收率（%5.04.8 0.495.4 7.5花生20.020.8 1.7104.2 8.560.064.7 5.5108.0 9.15.03.9 0.277.7 4.2玉米20.016.9 0.384.7 1.760.050.4 1.

26、484.1 2.43结论利用核酸适体能对靶物质特异性结合迫使互补链解离的作用，建立了核酸适体识别AFB1荧光恢复检测法。该法操作简便、灵敏度高、选择性好，可以满足实际样品中AFB1的检测需求。该检测方法的原理同样适用于对其他基于核酸适体检测小分子靶物质的方法设计。鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫摇饬缗。参考文献1 SCHOENTAL, R. Epidemiology of aflatox in formation by Aspergillus flavusJ. Ann ual Review of Phytopathology, 1987, 25(25):249-270硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹鸶胶据。2 COT

27、TY P J, BHATNAGAR D. Variability amo ng atoxige nic Aspergillus flavus strai ns in ability to preve nt aflatoxin con tam in ati on and producti on of aflatox in bios yn thetic pathway en zymeJ. Applied & Environmen tal Microbiology, 1994, 60(7): 2248-2251阌擻輳嬪諫迁择植秘騖輛埙鵜。3 PARKIN D M, BRAY F, FERLAY J,

28、et al. Global Cancer Statistics, 20XX & daggerJ. Ca A Cancer Journal for Clinicians, 20XX, 55(2):74-08氬嚕躑竄贸恳彈濾颔澩纷釓鄧。4 GB 2761 - 20XX.食品安全国家标准食品中真菌毒素限量S.北京：中国标准出版社,20XX釷鹆資贏車贖孙滅獅赘慶獷緞。GB 2761 - 20XX.National food safety standard-Limit of mycotoxins in foodsS. Beijing: Standards Press of China, 20XX (in

29、 Ch in ese)怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉馴鸨撟。5 KORRAPATI K, MOHANAMBA T, RATHNA K L. Assessme nt of aflatoxin B1 in livestock feed and feed in gredie nts by high-performa nee thin layer chromatographyJ. Veteri nary World, 20XX, 8(12):1396-1399谚辞調担鈧谄动禪泻類谨觋鸾。6 LV JL, YANG YL.Determination Of Aflatoxin B1 and B2 in peanut

30、 and Peanut oil using cloud point extraction followed by Ultra-High-Performance Liquid ChromatographyJ. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 20XX, 36(10): 1421-1436 嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩癱恳迹。7 NICHOLAS Z, RYBAK M E, ZHONG L, et al. Determination of Aflatoxin B1 in Smokeless Tobacco Products

31、by Use of UHPLC-MS/MSJ. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 20XX, 63(41):9131-9138 熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库圆鍰缄。8 ANFOSSI L, DI NARDO F, GIOVANNOLI C, et al. Enzyme immunoassay for monitoring aflatoxins in eggsJ. Food Control, 20XX, 57: 115-121 鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞阕簣择。9 MA H, SUN J, ZHANG Y,et al. Disposable amperomet

32、ric immunosensor for simple and sensitive determination of aflatoxin B1, in wheatJ. Biochemical Engineering Journal, 20XX, 115:38-46 纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛覲僨鴛。10 YAO M, WANG L, FANG C. The chemiluminescence immunoassay for aflatoxin B1 based on functionalized magnetic nanoparticles with two strategies of antige

33、n probe immobilizationJ. Luminescence, 20XX, 32(4):661-665 颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷涨负這。11 GE H, JIANG Y, LIAN F, et al. Quantitative determination of aflatoxin B1 concentration in acetonitrile by chemometric methods using terahertz spectroscopyJ. Food Chemistry, 20XX, 209:286-292 濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻減栖 綜。12 SHIM W B, KIM M

34、 J, MUN H, et al. An aptamer-based dipstick assay for the rapid and simple detection of aflatoxin B1J. Biosensors & Bioelectronics, 20XX, 62(6):288-294 銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼鏗穎報。13 GOPINATH S C. Methods developed for SELEXJ. Analytical & Bioanalytical Chemistry,20XX, 387(1): 171-182 挤 貼綬电麥结鈺贖哓类芈罷鸨。14 STOLTENBUR

35、GR R C, SREEHLITZB. SELEX-Arevolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligandsJ. Biomolecular Engineering,20XX, 24(4):381-403 赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈極嚕辫。15 ZHOU W, KONG W, DOU X,et al. An aptamer based lateral flow strip for on-site rapid detection of ochratoxin A in Astragalus membranaceusJ. Jou

36、rnal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 20XX, 1022: 102-108塤礙籟馐决穩賽釙冊庫麩适绲。16 LIU R, HUANG Y, MA Y,et alDesign and synthesis of target-responsive aptamer-cross-linked hydrogel for visual quantitative detection of ochratoxin AJ. Acs Applied Materials & Interf

37、aces, 20XX, 7(12): 6982-6990 裊樣祕廬廂颤谚鍘 羋蔺递灿扰。17 MODH H B, BHADRA A K, PATEL K A, et al. Specific detection of tetanus toxoid using an aptamer-based matrixJ. Journal of Biotechnology, 20XX, 238:15-21 仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁絛鯛鱧。18 ES -R M A, Ba EZD F,JODRAA, et al. Aptamer-Modified Graphene-BasedCatalytic Micromoto

38、rs: Off -On Fluoresce nt Detection of Rici nJ.ACS Sen sors, 20XX, 1(3): 217-221 绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾 瀧恒蟬轅。19 WANG Y X, YE Z Z, YING Y B. Detection of immunoglobulin E using an aptamer based dot-blot assayJ. Chinese Science Bulletin, 20XX, 58(24):2938-2943 骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙骠弒綈。20 YAO X, MA X, DING C,et al. Colorimetri

39、c determination of lysozyme based on the aggregation of gold nanoparticles controlled by a cationic polymer and an aptamerJ. Microchimica Acta, 20XX, 183(7):2353-2359 瑣钋濺 暧惲锟缟馭篩凉貿锕戧。21 CHANG C C, CHEN C Y,CHUANG T L,et al. Aptamer-based colorimetric detection of proteins using a branched DNA cascade

40、 amplification strategy and unmodified gold nanoparticlesJ. Biosensors & Bioelectronics, 20XX, 78:200-205 鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類碍穑鳓。22 KUANG L, CAO S P, ZHANG L, et al. A novel nanosensor composed of aptamer bio-dots and gold nanoparticles for determination of thrombin with multiple signalsJ. Biosensors & Bioel

41、ectronics, 20XX, 85:798-806 栉缏歐锄棗鈕种 鵑瑶锬奧伛辊。23 GOLUB E, ALBADA H B, LIAO W C,et al. Nucleoapzymes: hemin/G-quadruplex DNAzyme -aptamer binding site conjugates with superior enzyme-like catalytic functionsJ.Journal of the American Chemical Society, 20XX, 138(1):164-172 辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应頁諳绞。24 Y, XU J, J M, e

42、t al. Colorimetric determ in ati on of 17 -estradiol based on he specific recog niti on of aptamer and the salt-induced aggregation of gold nanoparticlesJ. Materials Letters, 20XX, 159:221-224 峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺诈 機愦。25 WANG P L, SU X O, SHI L,et al. An aptamer based assay for the beta-adrenergic agonist rac

43、topamine based on aggregation of gold nanoparticles in combination with a molecularly imprinted polymerJ.MicrochimActa,20XX, 183(11): 2899-2905 詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜靈韬鰍。26 GUO J, LI Y, WANG L, et al. Aptamer-based fluorescent screening assay for acetamiprid via inner filter effect of gold nanoparticles on the

44、fluorescence of CdTe quantum dotsJ. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 20XX, 408(2): 557-566 则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷华缙輅。27 SOHEILI V, TAGHDISI S M, KHAYYAT M H, et al. Colorimetric and ratiometric aggregation assay for streptomycin using gold nanoparticles and a new and highly specific aptamerJ.Microchimica A

45、cta, 20XX, 183(5):1687-1697 胀鏝彈 奥秘孫戶孪钇賻锵咏繞。28 Tian Y, Wang Y, Sheng Z,et al. A colorimetric detection method of pesticide acetamiprid by fine-tuning aptamer lengthJ. Analytical Biochemistry, 20XX, 513: 87-92 鳃躋峽祷紉诵帮废掃減萵輳慘。29 WANG L, LIU F, SUI N, et al. A colorimetric assay for Hg(II) based on the u

46、se of a magnetic aptamer and a hybridization chain reactionJ. Microchimica Acta, 20XX, 183 (11): 2855-2860 稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜椤灣鲳。30 TANG M, WEN G, LIANG A,et al. A simple and sensitive resonance Rayleigh scattering method for determination of As(III) using aptamer-modified nanogold as a probeJ. Luminescence

47、 the Journal of Biological & Chemical Luminescence, 20XX, 29(6):603-608 陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟麗鲍轸。31 ZANG Y, LEI J, HAO Q, et al. Signal-on photoelectrochemical sensing strategy based on target-dependent aptamer conformational conversion for selective detection of lead(II) ionJ.Acs Applied Materials & Interfaces, 20XX, 6(18):15991-15997 沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應釵蔼绋。32 WANG K, FAN D, LIU Y, WANG E. Highly sensitive and specific colorimetric detection of cancer cells via dual-aptamer target binding strategyJ. Biosensors & Bioelectronics, 20XX, 73:1-6 钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺缔嵛恽。33 SUN D, LU J, ZHONG Y, et al. Sensitive electro