百蕊草的吸器诱导及发育信号物质的分离鉴定

1、百蕊草的吸器诱导及发育信号物质的分离鉴定百蕊草Thesium Chinense Turcz.为檀香科百蕊草属多年生半寄生药用植物【1】，在我国东部省区分布范围较广，日本和朝鲜也有分布。中国药典（1977年）、中药大辞典（1977年）、新华本草纲要（1988年）和中华本草（1999年）等多部药学典籍均有收载，具有清热解毒、补肾涩精、解暑利湿作用。现代研究表明百蕊草具有显著抗炎、镇痛和广谱抗菌作用，被誉为植物抗生素;。目前，百蕊草主要以野生资源供应市场需求，随着需求量的日益增加，人工栽培势在必行。但其栽培生理基础研究非常薄弱，极大限制了百蕊草的人工栽培。作为兼性半寄生植物，百蕊草寄主植物种类广泛，

2、生长在其周围的草本或木本植物大都可被其寄生。夏枯草Prunella vulgaris不仅是常见的药用植物，也是百蕊草最为普遍的寄主植物之一。吸器是寄生植物的特殊器官，是寄生植物从寄主吸取营养物质的通道，寄主植物释放的次生代谢产物作为化学信号物质，在寄生关系的建立过程中起着关键作用。研究表明，2，6-二甲氧基-对苯醌（DMBQ）是最为普遍有效的寄生植物吸器发生信号物质，其核心结构是1，4-对苯醌。因此，本实验在前人研究的基础上，利用GC-MS鉴定百蕊草优势寄主植物夏枯草根系分泌物，并用DMBQ对百蕊草幼苗进行处理，观察其对吸器的诱导情况，旨在为从根本上探讨和解决百蕊草人工栽培的关键问题提供理论参

3、考。1 材料1.1 植物夏枯草种子采集于江苏南京，百蕊草种子采集于江苏镇江，经南京农业大学郭巧生教授鉴定为夏枯草P. vulgaris及百蕊草T. Chinense的成熟种子。1.2 试剂和仪器RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），HP6890GC/5973MSD 气相色谱-质谱联用仪（Hewlett Packard 公司），人工气候箱（浙江托普仪器有限公司），SZX7体式显微镜（OLYMPUS），DMBQ，Amberlite XAD-4吸附树脂（Sigma-Aldrich），GA3，HCl，甲醇均为国产分析纯。2 方法2.1 百

4、蕊草吸器发育信号物质的分离鉴定2.1.1 寄主植物的培养及根系分泌物的收集 将采集的夏枯草种子用蒸馏水冲洗干净，浸泡24 h，种植于石英砂上（石英砂粒径约1 mm，用2 mol-L-1的HCl浸泡24 h后，再用蒸馏水冲洗至中性，110 高温灭菌3 h后，置于循环收集装置容器中），培养期间定期用Hoagland营养液浇灌。待夏枯草根系布满整个循环收集装置，将XAD-4吸附树脂柱接入装置，循环收集7 d，用5倍柱体积甲醇洗脱。洗脱液45 恒温浓缩至干。浓缩物加入甲醇溶解后，取滤液进行GC-MS分析测试。按同样方法收集无夏枯草的石英砂洗脱液为对照。2.1.2 GC-MS分析 将收集的夏枯草根系分泌

5、物于HP6890/5973MSD 气相色谱-质谱联用仪进行测定。测定采用DB-5石英毛细管色谱柱（0.25 mmx30 m， 0.25 μm），进样口温度280 ，按程序升温，初始温度为50 ，以10 -min-1的升温速率升至290 ;维持10 min。载气为高纯氦气，流量1.0 mL-min-1;进样量1 μL;分流比201。EI 电离源，电子能量70 eV;离子源温度230 ;接口温度280 ，扫描质量m/z 35500全扫描。2.2 DMBQ对百蕊草吸器诱导的影响2.2.1 百蕊草种子预处理 将采集到的百蕊草种子自然风干，去除杂质和空瘪种子后，选留成熟饱满的种子用流水冲洗2

6、4 h，再用500 mg-L-1的GA3水溶液浸种泡24 h，捞出后晾干种子表面水分。将处理后的百蕊草种子与河沙按13混合均匀，基质含水量以手握成团，松手即散;为宜，置于4 冰箱中层积处理150 d以打破种子休眠。2.2.2 DMBQ诱导百蕊草吸器形成 百蕊草种子打破休眠萌发后，用蒸馏水冲洗干净，种于穴盘中，栽培基质为石英砂。将穴盘放置于人工气候箱中进行培养（培养温度25 ，12 h-d-1昼夜变化，3040 μmol-m-2-s-1的光照强度）。待百蕊草小苗生长至5 cm高左右，配施5个浓度梯度DMBQ水溶液（1 000，100，10，1，0.1 μmol-L-1）处理百蕊草幼苗

7、根系，以蒸馏水处理为对照，每个处理均做30个重复（30株幼苗）。培养20 d，挖出百蕊草根系，冲洗干净根系表面的石英砂，置于体式显微镜下，观察吸器的发生情况，并统计吸器的发生数目，同时称量各根系的质量。3 结果与分析3.1 夏枯草根系分泌物的GC-MS鉴定结果夏枯草根系分泌物GC-MS的总离子流图见图1，根据NIST标准谱库检索和质谱裂解规律核对，从夏枯草根系分泌物中鉴定得到9类53种化合物见表1，其中烃类化合物13种、酯类化合物有12种、有机酸类化合物9种、酮类化合物7种、醇类化合物6种、含氮类化合物3种，酚酸类、醛类和醌类化合物分别只检测出1种。虽然在夏枯草根系分泌物中，酚醌类物质被检测出

8、来的种类少，相对含量较低，但2，4-二叔丁基苯酚和2，5-二叔丁基-1，4-苯醌在化学结构上具有苯环结构，特别是2，5-二叔丁基-1，4-苯醌具有1，4-对苯醌的核心结构，与普遍报道的吸器诱导物质DMBQ结构类似，这类物质有可能在寄生植物根际的氧化还原反应中，发生电子转移，在酚、醌和半醌的状态转换过程中，给予吸器形成的某种信号。图1 夏枯草根系分泌物的总离子流图Fig.1 TICs of secretions from roots of Prunella vulgaris表1 夏枯草根系分泌物中化合物气质联用鉴定Table 1 Compounds from root exudates of P

9、runella vulgaris identified by GC-MS类别 保留时间/min相对质量分数/%化合物成分醇类5.620.19 1，1-dimethyl-decyl-mercaptan 1，1-二甲基十一硫醇8.830.32tert-dodecylthiol 叔十二烷基硫醇9.990.322，4，7，9-tetramethyl-5-decyne-4，7-diol10.870.24tridecanol 十三烷醇14.630.102-hexyl-1-decanol 2-己基-1-癸醇15.720.331-tetradecanol 1-十四醇酚酸类11.470.362，4-di-ter

10、t-butylphenol 2，4-二叔丁基苯酚含氮类18.700.38butyraldoxime 丁醛肟19.3421.51 2-（1-aminocyclohexyl）-5，7-dinitro-1，3-benzoxazole20.350.22oleamide 油酸酰胺醌类22.030.03 2，5-di-tert-butyl-1，4-benzoquinone 2，5-二叔丁基-1，4-苯醌醛类9.750.16undecanal 十一醛烃类7.590.12octane 辛烷8.910.121，6-diacetylhexane 1，6-二甲基己烷11.800.14hexadecane 正十六烷1

11、3.510.20（cis）-2-nonadecene17.700.111-eicosene 1-二十碳烯18.230.721-chlorohexadecane 氯代十六烷19.590.13tetradecane 正十四烷21.200.50nonacosane 二十九烷21.320.191-bromohexadecane 溴代十六烷21.970.32triacontane 三十烷22.290.12trichlorododecyl- silane 正十二烷基三氯硅烷22.700.23eicosane 二十烷续表1类别保留时间/min相对质量分数/%化合物成分23.675.41 2，2-dimeth

12、yl-3-（3，7，16，20-tetramethyl-heneicosa-3，7，11，15，19-pentaenyl）-oxirane酮类5.450.20triacetone triperoxide 三过氧化三丙酮13.770.164-methyl-2-hexanone 4-甲基己酮14.340.223-methyl-2-heptanone 3-甲基庚酮15.940.132-pentadecanone 2-十五烷酮16.222.53 7，9-di-tert-butyl-1-oxaspiro（4，5）deca-6，9-diene-2，8-dione16.450.323，4-dimethyl-

13、2-hexanone 3，4-二甲基己酮19.386.90 trans-12a，12b-dihydro-3a（12C），9a（9b）-dihomoperylene-3，10-dione有机酸类7.190.20hexanoic acid 己酸9.320.11decanoic acid 癸酸10.940.30succinic acid 琥珀酸12.210.29lauric acid 月桂酸14.552.87myristic acid 肉豆蔻酸15.240.09trichloroacetic acid 三氯乙酸15.550.59pentadecanoic acid 正十五酸16.350.109-he

14、xadecenoic acid 十六烯酸16.7913.93palmitic acid 棕榈酸酯类10.530.13dimethyl phthalate 邻苯二甲酸二甲酯12.341.50dimethyl succinate 丁二酸二甲酯12.6214.25diethyl phthalate 邻苯二甲酸二乙酯13.620.30diisobutyl adipate 己二酸二异丁酯13.700.19oxybis（methyl-2，1-ethanediyl） diacrylate15.640.22diisobutyl phthalate 邻苯二甲酸二异丁酯19.790.12oxalic acid，

15、dodecyl isohexyl ester20.430.38dioctyl adipate 己二酸二辛酯20.9811.13octadecanoic acid 3-hydroxypropyl ester21.034.37tetracosanoic acid， 23-oxo-， methyl ester21.641.87phthalic acid， mono-（2-ethylhexyl） ester23.730.16 acetic acid， -， trimethylsilyl ester3.2 不同浓度DMBQ诱导百蕊草吸器形成DMBQ能够诱导百蕊草幼苗形成吸器，但不同浓度DMBQ溶液处理间

16、差异显著，见表2。其中，在1 μmol-L-1 DMBQ诱导60 d后，每株百蕊草幼苗根系可诱导产生近20个吸器，其诱导能力最强;高浓度DMBQ（101 000 μmol-L-1）处理不利于诱导产生吸器，在1 000 μmol-L-1 DMBQ处理下，百蕊草植株矮小萎蔫，根系生长较弱，吸器形成数目较少，这可能是由于处理溶液浓度太高，已经影响了百蕊草根系的正常生理活动。通过计算吸器形成数与根系质量的比值，可以得到单位根系上所诱导产生的吸器数目，以1 μmol-L-1 DMBQ处理的比值最高，达到了110.52，可以表明该浓度下的DMBQ诱导能力最强。表2 不同浓度DMBQ

17、溶液处理百蕊草根系吸器诱导情况Table 2 Haustoria of Thesium chinense induced under different concentration of DMBQ treatmentsDMBQ/μmol-L-1吸器的形成数目/个/株根系质量/g/株比值1 0000.14±0.35e0.06±0.04d2.381001.97±1.09d0.16±0.04c12.23105.28±1.77c0.19±0.04b26.75119.93±4.74a0.18&plus

18、mn;0.03bc110.520.116.24±4.87b0.22±0.06a73.360（H2O）0.62±0.86de0.19±0.04b3.21注：差异显著性分析取α=0.05水平， 同一列中含有不相同字母者为差异显著。4 讨论与结论寄主植物释放的次生代谢产物作为化学信号物质，在寄生关系的建立过程中起着关键作用，对于根寄生植物来说，根系分泌物对于其吸器的发育和寄生关系的建立至关重要。吸器的发生与形成需要寄主植物次生代谢物质的参与，此过程包括化学信号刺激的感应及早期细胞的扩增和分化，与寄主植物的接触并侵入，而连通寄主植物和寄生植物的维管组织的成熟标志着功能吸器的建成。前期研究表明，半寄生植物百蕊草只有在寄主植物存在的条件下才形成吸器，表明寄主植物根系分泌的某些物质可诱导吸器的发育。对百蕊草寄主植物根系分泌物中吸器诱导信号物质分离、鉴定，对进一步研究诱导机制具有很好的指导意义。本研究利用GC-MS方法检测百蕊草的优势寄主植物夏枯草根系中释放的分泌物，鉴定得到具有1，4-对苯醌核心结构的2，5-二叔丁基-1，4-苯醌，这对进一步研究夏枯草与百蕊草寄生关系的建立机制具有重要意义。对苯醌类物质是目前提取出的寄生植物吸