细胞培养1：从体内到体外

1、体外培养的原理与技术体外培养的原理与技术薛庆善薛庆善 主编主编广西医科大学组胚教研室广西医科大学组胚教研室何少健何少健电话：电话：13367805949133678059490771-5358577(办办) )本课程由理论课和实验课组成。最终成绩由下列二部分组成：1. 实验操作技能考核；2. 作业：我的培养计划课课 程程 安安 排排 及及 进进 度度实验课时间：第实验课时间：第7 9周周实验课地点：实验课地点：104馆四楼馆四楼注意事项：注意事项：1.1.网上没有名字的网上没有名字的 同学同学请不要填报实请不要填报实 验课名单。验课名单。2.2.现在不能确定现在不能

2、确定 自己时间的同学自己时间的同学 不要填报，可以不要填报，可以 下次上课时再报。下次上课时再报。3.3.一旦填报就不能一旦填报就不能 再更改时间。再更改时间。体外培养（体外培养（in vitro culture）的概念的概念将活体结构成分取出，放在类似于体内将活体结构成分取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。方法。细胞培养细胞培养（cell culturecell culture） 组织培养组织培养（tissue culturetissue culture）器官培养器官培养（organ cultureorgan culture）

3、 体外培养技术的应用体外培养技术的应用 在在组织学与胚胎学组织学与胚胎学领域的应用领域的应用 在在细胞生物学细胞生物学领域的应用领域的应用 在在肿瘤学肿瘤学方面的应用方面的应用 在在微生物学微生物学领域的应用领域的应用 在在免疫学免疫学方面的应用方面的应用 在在药理学药理学领域的应用领域的应用体外培养的优点体外培养的优点 简化细胞的生长环境简化细胞的生长环境 方便施加实验因素方便施加实验因素 容易观测实验结果容易观测实验结果 便于获得均一细胞群便于获得均一细胞群 能够进行大规模生物制品的生产能够进行大规模生物制品的生产体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长

4、条件一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法六、培养物的观察检测方法一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件体外（体外（in vitro）培养技术就其实质而言，培养技术就其实质而言，就是模拟体内（就是模拟体内（in vivo）的生理环境，在无的生理环境，在无菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下，菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下，使活体的结构成分在体外环境中生

5、存和生长，使活体的结构成分在体外环境中生存和生长，并维持其结构和功能。并维持其结构和功能。一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件（一）体内细胞生存的营养条件（一）体内细胞生存的营养条件（二）体内细胞生存的其它条件（二）体内细胞生存的其它条件（三）体外生长大环境（三）体外生长大环境（四）培养用液（四）培养用液（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件（六）清洗和消毒（六）清洗和消毒、水（、水（waterwater）、无机盐（、无机盐（inorganic saltinorganic salt）、葡萄糖（、葡萄糖（glucoseglucose）、维生素（、

6、维生素（vitaminvitamin）、氨基酸（、氨基酸（amino acidamino acid）（一）体内细胞生存的营养条件（一）体内细胞生存的营养条件、温度（、温度（temperaturetemperature）、氧和酸碱度、氧和酸碱度 （oxygenoxygen and power of hydrogenand power of hydrogen）、体液渗透压、体液渗透压 （osmotic pressure osmotic pressure of of humorhumor）、细胞之间的相互联系、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件（二）体内细胞生存的其它条件温度对细胞生存的

7、影响温度对细胞生存的影响高热高热( (hyperthermyhyperthermy) )对细胞生存的影响：对细胞生存的影响：高热高热导致酶的变性而失活导致酶的变性而失活破坏细胞膜的类脂质破坏细胞膜的类脂质细胞核分裂异常细胞核分裂异常破坏纺锤体破坏纺锤体细胞浆外层的钙释放细胞浆外层的钙释放代谢停止代谢停止细胞膜渗透性变化细胞膜渗透性变化多极分裂出现多极分裂出现停止在中期停止在中期凝固酶使细胞凝固凝固酶使细胞凝固低温低温(hypothermy)(hypothermy)大多数细胞在接近冰点的温度下仍能存活，当大多数细胞在接近冰点的温度下仍能存活，当温度达到冰点时细胞活动就要相对停止。温度达到冰点时细

8、胞活动就要相对停止。温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓度升高。度升高。细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至-40-40时，细胞外时，细胞外 的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内 引起冰晶。引起冰晶。快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶，不仅使快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶

9、，不仅使细胞内的溶质浓度增高到有害的程度，细胞内的溶质浓度增高到有害的程度，而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。所以：在冷冻状态下，要减少细胞的损伤，所以：在冷冻状态下，要减少细胞的损伤，应逐渐降温，而不宜迅速降温。应逐渐降温，而不宜迅速降温。低温低温(hypothermy)(hypothermy)、温度（、温度（temperaturetemperature）、氧和酸碱度、氧和酸碱度 （oxygenoxygen and power of hydrogenand power of hydrogen）、体液渗透压、体液渗透压 （osmotic pressure

10、osmotic pressure of of humorhumor）、细胞之间的相互联系、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件（二）体内细胞生存的其它条件、氧和酸碱度、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）氧氧酸碱度酸碱度 酸度和碱度的度量采用酸度和碱度的度量采用pH表示，表示， pH即氢离子浓度即氢离子浓度的负对数值。的负对数值。各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐受的受的pH范围

11、为范围为6.08.0。人类血液的。人类血液的pH值一般维持在值一般维持在7.367.44。是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细胞缺氧不能生存。胞缺氧不能生存。、温度（、温度（temperaturetemperature）、氧和酸碱度、氧和酸碱度 （oxygenoxygen and power of hydrogenand power of hydrogen）、体液渗透压、体液渗透压 （osmotic pressure osmotic pre

12、ssure of of humorhumor）、细胞之间的相互联系、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件（二）体内细胞生存的其它条件、体液渗透压（、体液渗透压（osmotic pressure osmotic pressure of of humorhumor）体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。血浆晶体渗透压：血浆晶体渗透压： 由由Na+、K+、 Cl、 HCO 3 等构成；等构成；血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；正常血浆渗透压范围为：正常血浆渗透压范围为：280310 mOsm

13、/kg 主要由晶体渗透压组成。主要由晶体渗透压组成。等渗溶液等渗溶液(isosmotic solution)：在正常血浆渗透压范围内的溶液；：在正常血浆渗透压范围内的溶液；高渗溶液高渗溶液(hyperosmotic solution)：高于：高于310 mOsm/kg的溶液；的溶液；低渗溶液低渗溶液(hyposmotic solution;)：低于：低于280 mOsm/kg的溶液。的溶液。、温度（、温度（temperaturetemperature）、氧和酸碱度、氧和酸碱度 （oxygenoxygen and power of hydrogenand power of hydrogen）、体

14、液渗透压、体液渗透压 （osmotic pressure osmotic pressure of of humorhumor）、细胞之间的相互联系、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件（二）体内细胞生存的其它条件、细胞之间的相互联系、细胞之间的相互联系 细胞间相互联系的基础是胞间通讯。细胞间相互联系的基础是胞间通讯。胞间通讯有三种类型：胞间通讯有三种类型：直接接触型：直接接触型：特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系；特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系；直接联系型：直接联系型：通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；间接联系型：间接联系型：是细胞间

15、通讯的最主要的途径。通过激素、是细胞间通讯的最主要的途径。通过激素、 神经递质、局部化学介导因子等化学信号神经递质、局部化学介导因子等化学信号 的传播。的传播。细胞增生的接触性抑制细胞增生的接触性抑制细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时，细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时，细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖到一定密度后，细胞增殖停止。到一定密度后，细胞增殖停止。这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。、体外培养实验室、体外培养实验室、体外培养实验室的设备和器具、体外培养实验室的设备和器具（三）体

16、外生长大环境（三）体外生长大环境、体外培养实验室、体外培养实验室由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须保由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因素组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因素的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发生的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发生烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清新烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清新区。区。实验室设计应根据研究任务、目的和规模（小组、研究

17、实验室设计应根据研究任务、目的和规模（小组、研究室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空间室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空间要求，最小不应小于要求，最小不应小于50m50m2 2。如接近。如接近50m50m2 2上下，以一大一小为上下，以一大一小为好。好。 、体外培养实验室、体外培养实验室 准备室准备室 培养室培养室 缓冲室缓冲室 其它实验室其它实验室实验台实验仪器台水池冰箱衣柜载物台离心机橱柜 载物台显微镜净化台培养箱冰箱递物小窗试剂柜准备室准备室培养室培养室缓冲室缓冲室专用培养实验室专用培养实验室布局示意图布局示意图、体外培养实验室、体外培养实验室、体外培养实验

18、室的设备和器具、体外培养实验室的设备和器具（三）体外生长大环境（三）体外生长大环境、体外培养实验室的设备和器具、体外培养实验室的设备和器具（）大型设备（）大型设备 和仪器和仪器（）培养器具（）培养器具超净工作台超净工作台(superclean bench)培养箱培养箱(incubator)倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)冰箱冰箱(refrigerator)冷冻保存冷冻保存(cryopreservation)装置装置细胞计数板和电子细胞计数仪细胞计数板和电子细胞计数仪离心机离心机(centrifugal machine)PH计计天平天平(equi-arm balan

19、ce)水纯化水纯化(water purification)装置装置高压蒸汽消毒高压蒸汽消毒(vapor sterilization)装置装置电热干燥箱电热干燥箱(drying oven)美国美国SHELLAB COSHELLAB CO2 2培养箱培养箱（）大型设备和仪器（）大型设备和仪器（）培养器具（）培养器具过滤除菌过滤除菌(filtration sterilization)装置装置手术器械手术器械(surgical instruments)培养器皿培养器皿(ware for culture)移液器移液器(transferpettor)特殊用具特殊用具杂用品杂用品、体外培养实验室的设备和器具

20、、体外培养实验室的设备和器具真空式过滤器真空式过滤器正压式不锈钢滤器正压式不锈钢滤器抽滤式玻璃简易型滤器抽滤式玻璃简易型滤器针头式滤器针头式滤器（）大型设备和仪器（）大型设备和仪器（）培养器具（）培养器具过滤除菌装置过滤除菌装置手术器械手术器械培养器皿培养器皿移液器移液器特殊用具特殊用具杂用品杂用品、体外培养实验室的设备和器具、体外培养实验室的设备和器具细胞过滤器细胞过滤器细胞冻存管细胞冻存管微量移液枪吸头微量移液枪吸头、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)、培养液、培养液(culture solution)、其它常用液、其它常用液进行体外培养

21、离不开适应细胞在体外生存和生长的各种进行体外培养离不开适应细胞在体外生存和生长的各种溶液，此即溶液，此即培养用液培养用液。培养用液培养用液主要包括主要包括培养液培养液、缓冲液缓冲液、平衡盐溶液平衡盐溶液、血清血清以及以及消化液消化液、pHpH调整液调整液和和抗生素液抗生素液等其它常用液。等其它常用液。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液水与缓冲液水与缓冲液生理盐水与生理盐水与平衡盐溶液平衡盐溶液培养用水培养用水缓冲溶液缓冲溶液生理盐水生理盐水平衡盐溶液平衡盐溶液、培养液、培养液、其它常用液、其它常用液（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液水是培养用

22、液最主要的溶剂。培养用液中的其它成分只有水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其它成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。用金属蒸馏器制备的蒸馏水（用金属蒸馏器制备的蒸馏水（distilled water，DW），可），可能会含有某些金属离子，能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水一般不作为培养用水。配制培养用液应用经配制培养用液应用经石英玻璃石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的蒸馏器三次蒸馏的三蒸水三蒸水或或超纯水净化装置制备的超纯水净化装置制备的超纯水超纯水。二次蒸馏水或外购的纯水只能用于清洗。二次蒸馏水或外购的纯水只能用于清洗。（）水与缓冲液（）水与缓冲液（buff

23、er solution）培养用水：培养用水：（四）培养用液（四）培养用液蒸馏水的蒸馏水的贮存贮存也很重要，蒸馏水应贮存于密封的清洗干也很重要，蒸馏水应贮存于密封的清洗干净的玻璃瓶内，最好用龙头瓶贮存，用时由瓶下端的玻璃龙净的玻璃瓶内，最好用龙头瓶贮存，用时由瓶下端的玻璃龙头放水。头放水。尽量少开启瓶口或从瓶口倒水，以防周围不洁的环境和尽量少开启瓶口或从瓶口倒水，以防周围不洁的环境和空气污染水。空气污染水。制备的水存放时间不宜太长，一般制备的水存放时间不宜太长，一般不超过不超过2周周，最好现最好现制现用制现用。若将所制备的蒸馏水经高压蒸汽消毒，可密封存放。若将所制备的蒸馏水经高压蒸汽消毒，可密封

24、存放较长时间。较长时间。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液（）水与缓冲液（）水与缓冲液（buffer solution）培养用水：培养用水：由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时其氢由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲（溶）液离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲（溶）液(buffer solution)(buffer solution)。缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。如或弱碱及这种弱碱与强酸所组成

25、的盐。如碳酸氢钠碳酸碳酸氢钠碳酸（NaHCONaHCO3 3H H2 2COCO3 3 ）、）、磷酸二氢钠磷酸氢二钠磷酸二氢钠磷酸氢二钠（NaHNaH2 2P0P04 4NaNa2 2HP0HP04 4），调节二者的比例便可以配成各种缓冲液。），调节二者的比例便可以配成各种缓冲液。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液（）水与缓冲液（）水与缓冲液（buffer solution）培养用水：培养用水：、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液（）生理盐水与平衡盐溶液（）生理盐水与平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BS

26、S）生理盐水生理盐水:生理盐水是培养用液中的一种重要类型和培养基的主要生理盐水是培养用液中的一种重要类型和培养基的主要成分，在体外培养中应用非常广泛。成分，在体外培养中应用非常广泛。它可以供给细胞水分和各种离子，维持一定的渗透压。它可以供给细胞水分和各种离子，维持一定的渗透压。同时，它也是一种良好的溶媒，用以溶解培养用的试剂或药同时，它也是一种良好的溶媒，用以溶解培养用的试剂或药物等。物等。（四）培养用液（四）培养用液平衡盐溶液平衡盐溶液:平衡盐溶液平衡盐溶液（简称（简称盐溶液盐溶液）集缓冲液的缓冲能力、生）集缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具理盐水的等渗性

27、以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度、同时供给细胞生维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。存所需的能量和无机离子成分的作用。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液（）生理盐水与平衡盐溶液（）生理盐水与平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BSS）平衡盐溶液平衡盐溶液:几种常用的几种常用的平衡盐溶液平衡盐溶液配方配方(g/L)(g/L)（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液（）生理盐水与平衡盐溶液（）生理盐水与

28、平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BSS）、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基血清血清胚胎浸出液胚胎浸出液水解乳蛋白水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养基的主要成分合成培养液的配制合成培养液的配制、培养液、培养液、其它常用液、其它常用液无血清培养基无血清培养基基础培养液基础培养液生长附加成分生长附加成分（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液(culture solution)天然培养基天然培养基(natural medium)：血清（血清（serums

29、erum）：）：血清（血清（serumserum）是体外培养中用得最多最广的天然培养基，）是体外培养中用得最多最广的天然培养基，绝大部分动物细胞的体外培养都要使用血清。绝大部分动物细胞的体外培养都要使用血清。血清在动物细胞生长培养基中起着多方面十分重要的作用：血清在动物细胞生长培养基中起着多方面十分重要的作用：能提供细胞生存、生长和增生所必需的生长调节因子；能提供细胞生存、生长和增生所必需的生长调节因子；能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基

30、质成分；的生长基质成分；（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液天然培养基：天然培养基：血清（血清（serumserum）：）：提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。载体蛋白还可使被结合的物质稳定或改变性质；载体蛋白还可使被结合的物质稳定或改变性质；在一些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤在一些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用；害的作用；给培养液提供良好的缓冲系统；给培养液提供良好的缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。酶的损害。（四）培养用

31、液（四）培养用液、培养液、培养液天然培养基：天然培养基：血清（血清（serumserum）：）：使用有血清的培养液进行培养，也有难以解决的问题：使用有血清的培养液进行培养，也有难以解决的问题：血清中也存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质。例如血清中也存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质。例如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等；补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等；血清的成分不明确，影响对结果的分析；血清的成分不明确，影响对结果的分析；不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。培养结果不稳定。（四）培养用液（四）培养用液胚胎浸出

32、液：胚胎浸出液：（略）（略）、培养液、培养液天然培养基：天然培养基：水解乳蛋白：水解乳蛋白： （略）（略）（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基血清血清胚胎浸出液胚胎浸出液水解乳蛋白水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养基的主要成分合成培养液的配制合成培养液的配制、培养液、培养液、其它常用液、其它常用液无血清培养基无血清培养基基础培养液基础培养液生长附加成分生长附加成分（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液合成培养基合成培养基(deffined medium)：根据培养细胞的类型选择适合其生长的

33、培养基根据培养细胞的类型选择适合其生长的培养基是非常重是非常重要的要的。培养基的选择有一定的。培养基的选择有一定的原则性原则性，也有一定的，也有一定的灵活性灵活性。对于已建成的对于已建成的细胞系细胞系常选用建系过程中最初使用的培养常选用建系过程中最初使用的培养基，这是选择培养基时必须考虑的原则。基，这是选择培养基时必须考虑的原则。对于开展新的培养工作，尤其是建立新的细胞系对于开展新的培养工作，尤其是建立新的细胞系/株，则株，则可参考有关文献，选择和尝试使用几种培养基进行培养和比可参考有关文献，选择和尝试使用几种培养基进行培养和比较，摸索各种培养条件。一旦成功，即可按同样的培养基、较，摸索各种培

34、养条件。一旦成功，即可按同样的培养基、血清和培养条件继续培养。血清和培养条件继续培养。（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液合成培养基：合成培养基：1 1合成培养基的种类合成培养基的种类： （略）（略）2 2合成培养基的主要成分：合成培养基的主要成分： （略）（略）3 3合成培养液的配制：合成培养液的配制：现在有各种各样的商品化的培养基可供选用：现在有各种各样的商品化的培养基可供选用：液体培养基液体培养基（liquid mediumliquid medium），购回后直接或稀释后），购回后直接或稀释后即可使用。即可使用。粉制培养基粉制培养基（popowderedwdered medium

35、 medium），按照说明书，简单），按照说明书，简单配制后即可使用，十分便利快捷。配制后即可使用，十分便利快捷。（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液合成培养基：合成培养基：3合成培养液的配制：合成培养液的配制：一般的配制过程是：一般的配制过程是：1) 1) 取清洗干净的大烧杯取清洗干净的大烧杯1 1个，加入新鲜制备的三蒸水，加热至个，加入新鲜制备的三蒸水，加热至15153030。2) 2) 加加1 1小袋培养基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗装粉剂培养基的袋，涮小袋培养基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗装粉剂培养基的袋，涮洗的水倒入大烧杯中，搅拌使粉剂溶解。洗的水倒入大烧杯中，搅拌使粉剂

36、溶解。3) 3) 按照说明书，加入所需量的按照说明书，加入所需量的NaHCONaHCO3 3以及其它可能需添加的成分。以及其它可能需添加的成分。4) 4) 加水至最终量。加水至最终量。5) 5) 用用pHpH计测定培养液的计测定培养液的pHpH值，必要时用值，必要时用1 mol/ L HC1 mol/ L HCl l或或1 mol/L 1 mol/L NaOHNaOH调节调节pHpH值，一般调至值，一般调至pH 7.0 pH 7.0 7.2, 7.2,因过滤除菌后，因过滤除菌后，pHpH值会升高约值会升高约0.200.20。6) 6) 用孔径为用孔径为0.22 0.22 m m 的微孔滤膜过滤

37、除菌。的微孔滤膜过滤除菌。7) 7) 分装，封瓶口。标记培养液名称和配制时间，置分装，封瓶口。标记培养液名称和配制时间，置44冰箱中贮存。冰箱中贮存。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基血清血清胚胎浸出液胚胎浸出液水解乳蛋白水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养基的主要成分合成培养液的配制合成培养液的配制、培养液、培养液、其它常用液、其它常用液无血清培养基无血清培养基基础培养液基础培养液生长附加成分生长附加成分（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液无血清培养基无血清培养基(serum-free

38、 medium，SFM)无血清培养基（无血清培养基（serum free mediumserum free medium，SFMSFM）有时亦称为化）有时亦称为化学限定性培养基或化学成分明确的培养基（学限定性培养基或化学成分明确的培养基（chemically chemically defined mediumdefined medium）。）。无血清培养基完全采用人工合成的化合物，是成分确定的无血清培养基完全采用人工合成的化合物，是成分确定的培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可

39、靠。养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可靠。无血清培养基也有不足之处，一是成本较高；二是无血清无血清培养基也有不足之处，一是成本较高；二是无血清培养基的针对性很强，一种无血清培养基仅适用于某一类细胞培养基的针对性很强，一种无血清培养基仅适用于某一类细胞的培养。的培养。（四）培养用液（四）培养用液、培养液、培养液无血清培养基无血清培养基（1 1）基础培养液）基础培养液不少合成培养液都可以作为无血清培养液的基础培养基不少合成培养液都可以作为无血清培养液的基础培养基（basal mediumbasal medium）。最常用的是）。最常用的是Ham F12Ham F12和和DMEMDMEM

40、混合培养液。混合培养液。两者以两者以1 1：1( V : V 1( V : V ）混合，再补加）混合，再补加6 615 ml HEPES15 ml HEPES与与1.2 1.2 g g/L NaHCO/L NaHCO3 3即可作为即可作为基础培养液基础培养液。（2 2）生长附加成分）生长附加成分补加何种营养成分主要由各实验室根据所培养细胞的补加何种营养成分主要由各实验室根据所培养细胞的种类而设定，没有完全统一的配方。种类而设定，没有完全统一的配方。（四）培养用液（四）培养用液、水与平衡盐溶液、水与平衡盐溶液、培养液、培养液消化液消化液消化酶抑制剂消化酶抑制剂pH调整液调整液抗生素液抗生素液谷氨

41、酰胺液谷氨酰胺液胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液EDTA溶液溶液胶原酶溶液胶原酶溶液、其它常用液、其它常用液NaHCO3溶液溶液HEPES溶液溶液（四）培养用液（四）培养用液、其它常用液、其它常用液在动物细胞体外培养中，除以上介绍的两大类重要培在动物细胞体外培养中，除以上介绍的两大类重要培养用液外，还有一些其它必不可少的常用液。养用液外，还有一些其它必不可少的常用液。主要包括分离细胞的主要包括分离细胞的消化液消化液，防止微生物污染的，防止微生物污染的抗生抗生素液素液，调整培养液酸碱度的，调整培养液酸碱度的pHpH调整液调整液。此外，还有用于进行培养物组织细胞形态学观察的各此外，还有用于进行培养物组织细

42、胞形态学观察的各种种染液染液。（四）培养用液（四）培养用液、其它常用液、其它常用液在原代细胞培养和细胞传代时，都要使用消化液，最常在原代细胞培养和细胞传代时，都要使用消化液，最常用的消化液是用的消化液是胰蛋白酶胰蛋白酶和和二乙烯四乙酸二钠（二乙烯四乙酸二钠（EDTAEDTA）两种溶两种溶液，其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型液，其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细

43、胞。表面并离散成单个细胞。（四）培养用液（四）培养用液（1 1）消化液）消化液、其它常用液、其它常用液（1 1）消化液）消化液1)1)胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液( (trypsintrypsin solution) solution)：胰蛋白酶的胰蛋白酶的主要作用主要作用是使细胞间的蛋白质水解而使细胞离散。是使细胞间的蛋白质水解而使细胞离散。不同的组织或细胞系对胰蛋白酶的作用反应不一样，胰蛋白酶不同的组织或细胞系对胰蛋白酶的作用反应不一样，胰蛋白酶分散细胞的活性还与其分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间浓度、温度和作用时间有关。有关。一般来说浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力一般

44、来说浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力越大。胰蛋白酶溶液在越大。胰蛋白酶溶液在pH8.0,pH8.0,温度为温度为3737时，作用能力最强。时，作用能力最强。因因CaCa2+2+、MgMg2+2+和血清、蛋白质可以降低胰蛋白酶的活性，所以配和血清、蛋白质可以降低胰蛋白酶的活性，所以配制胰蛋白酶溶掖应选用制胰蛋白酶溶掖应选用不含不含CaCa2+2+、MgMg2+2+的的BSSBSS（ CaCa2+2+-Mg-Mg2+2+ free BSSfree BSS），），如如 D-Hanks D-Hanks 液液。（四）培养用液（四）培养用液 2) EDTA2) EDTA溶液：溶液：EDTAE

45、DTA是一种化学螯合剂，其溶液又称是一种化学螯合剂，其溶液又称VerseneVersene液液，对细胞有，对细胞有一定的解离作用，且毒性少、价格便宜，使用方便。一定的解离作用，且毒性少、价格便宜，使用方便。常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，这主要根据培养细胞的种类进行选择。这主要根据培养细胞的种类进行选择。3 3）胶原酶溶液（）胶原酶溶液（collagenasecollagenase solution solution）：）：有有胶原酶胶原酶I I、IIII、IIIIII、IVIV型型以及以及肝细胞专用胶原酶肝细胞专用胶原酶五种

46、。五种。（四）培养用液（四）培养用液、其它常用液、其它常用液（1 1）消化液）消化液（2 2）消化酶抑制剂（）消化酶抑制剂（enzyme inhibitor）、其它常用液、其它常用液贴壁生长的细胞传代时须使用消化酶使细胞脱离生长贴壁生长的细胞传代时须使用消化酶使细胞脱离生长表面。表面。在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用。细胞的作用。在无血清培养时，则必须使用消化酶抑制剂，以保护在无血清培养时，则必须使用消化酶抑制剂，以保护细胞免受残留的消化酶的损害。细胞免受残留的消化酶的损害。目前常用的酶抑制剂是目前常用的酶抑制剂是大豆胰酶抑

47、制剂大豆胰酶抑制剂。（四）培养用液（四）培养用液、其它常用液、其它常用液（3 3） pHpH调整液调整液 1) NaHCO1) NaHCO3 3溶液：溶液：为了使培养液营养成分稳定和延长贮存时间，为了使培养液营养成分稳定和延长贮存时间，一般不预先一般不预先在培养液中或平衡盐溶液中直接加入在培养液中或平衡盐溶液中直接加入NaHCONaHCO3 3，而是单独配制，而是单独配制，消毒除菌后，在消毒除菌后，在使用前加入使用前加入。 2) HEPES2) HEPES溶液：溶液：HEPESHEPES的化学名全称为：的化学名全称为：羟乙基哌嗪乙硫磺酸羟乙基哌嗪乙硫磺酸。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒

48、定的它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pHpH范围，范围，尤其是在开瓶通气培养或观察时能维持正常尤其是在开瓶通气培养或观察时能维持正常pHpH。（四）培养用液（四）培养用液、其它常用液、其它常用液（4 4）抗生素液）抗生素液为了预防因无菌操作不严而发生污染，培养液内一般需为了预防因无菌操作不严而发生污染，培养液内一般需加入适量的抗生素。加入适量的抗生素。用于体外培养的抗生素以用于体外培养的抗生素以青霉素青霉素应用最普遍。通常在培应用最普遍。通常在培养液中的养液中的终浓度终浓度为为2020100100U/mlU/ml。青霉素青霉素可以和可以和链霉素链霉素（使用浓度为（使用浓度为50 50

49、 g/ml)g/ml)联合应用联合应用抑制耐青霉素的菌株。抑制耐青霉素的菌株。（5 5）谷氨酰胺溶液）谷氨酰胺溶液（略）（略）（四）培养用液（四）培养用液实验课时间：第实验课时间：第7 9周周实验课地点：实验课地点：104馆四楼馆四楼注意事项：注意事项：1.1.网上没有名字的网上没有名字的 同学同学请不要填报实请不要填报实 验课名单。验课名单。2.2.现在不能确定现在不能确定 自己时间的同学自己时间的同学 不要填报，可以不要填报，可以 下次上课时再报。下次上课时再报。3.3.一旦填报就不能一旦填报就不能 再更改时间。再更改时间。、无污染的、无污染的气、液相环境气、液相环境、温度、温度、生长基质

50、、生长基质O2CO2液相环境液相环境多聚赖氨酸多聚赖氨酸纤维连接蛋白纤维连接蛋白胶原胶原层粘连蛋白层粘连蛋白亲玻粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素韧粘素（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、无污染的气、液相环境、无污染的气、液相环境体外培养技术体外培养技术特别强调特别强调无菌操作。无菌操作。组织取材、细胞分离、种植、传代、孵育以及利用培组织取材、细胞分离、种植、传代、孵育以及利用培养的细胞进行各种实验时，都必须在无污染环境下进行；养的细胞进行各种实验时，都必须在无污染环境下进行；培养所用的各种器具、液体以及其它用品都需严格消毒灭培养所用的各种器具、液体以及其它用品都需严格消毒灭

51、菌，以保证培养物不被污染。菌，以保证培养物不被污染。在无污染的前提下，必须为培养物提供适宜其生存和在无污染的前提下，必须为培养物提供适宜其生存和生长的气、液相环境。生长的气、液相环境。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、无污染的气、液相环境、无污染的气、液相环境气体环境气体环境是细胞生存的必要条件之一。是细胞生存的必要条件之一。供应气体的方式是向培养箱内通入含有一定比例供应气体的方式是向培养箱内通入含有一定比例COCO2 2的空的空气。其中，与细胞生命活动密切相关的气体主要有气。其中，与细胞生命活动密切相关的气体主要有O O2 2和和COCO2 2。O O2 2和和C

52、OCO2 2以气体扩散方式进入培养液和培养物内。以气体扩散方式进入培养液和培养物内。O O2 2(oxygen)(oxygen)参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量。能量。COCO2 2（carbon dioxidecarbon dioxide）主要与维持培养液的酸碱度有直）主要与维持培养液的酸碱度有直接关系。接关系。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、无污染的气、液相环境、无污染的气、液相环境体外细胞生长的体外细胞生长的液相环境液相环境是各种是各种平衡盐溶液平衡盐溶液或或培养液培养液。水和无机盐是其中最主要的成分，并由它们

53、构成溶液的水和无机盐是其中最主要的成分，并由它们构成溶液的渗透压，也就是细胞膜外的渗透压。渗透压，也就是细胞膜外的渗透压。在配制各种培养用液时，必须严格按照配方和配制方法在配制各种培养用液时，必须严格按照配方和配制方法的要求进行，以保证溶液为等渗。的要求进行，以保证溶液为等渗。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、无污染的、无污染的气、液相环境气、液相环境、温度、温度、生长基质、生长基质O2CO2液相环境液相环境多聚赖氨酸多聚赖氨酸纤维连接蛋白纤维连接蛋白胶原胶原层粘连蛋白层粘连蛋白亲玻粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素韧粘素（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的

54、其它条件、温度、温度无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一是是恒定的和适宜的恒定的和适宜的温度环境。温度环境。人和哺乳动物培养细胞的最适温度在人和哺乳动物培养细胞的最适温度在35353737，偏离，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。至导致死亡。培养的细胞对低温的耐受力比对高温强。培养的细胞对低温的耐受力比对高温强。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生

55、长的其它条件高温的影响：高温的影响：温度上升不超过温度上升不超过3939时，细胞的代谢强度与温度成正比。时，细胞的代谢强度与温度成正比。细胞在细胞在39394040中培养中培养1h1h，即会受到一定损伤，但仍能恢，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在复。当在41414242的温度条件下培养的温度条件下培养1h1h，细胞则会受到严重损，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温度达当温度达4343以上以上时，细胞大多死亡。时，细胞大多死亡。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、温度、温度低温的影响：低温的影响：对于温度

56、低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低对于温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于于0时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。细胞在细胞在2535条件下仍能生存和生长，但速度缓慢。条件下仍能生存和生长，但速度缓慢。若将培养的细胞放在若将培养的细胞放在4下数小时后，再置下数小时后，再置37培养，细培养，细胞仍能继续良好地生长。细胞代谢随温度降低而减缓。胞仍能继续良好地生长。细胞代谢随温度降低而减缓。温度降至冰点以下时，细胞胞浆结冰可以导致细胞死亡。温度降至冰点以下时，细胞胞浆结冰可以导致细胞死亡。（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生

57、长的其它条件、温度、温度、无污染的、无污染的气、液相环境气、液相环境、温度、温度、生长基质、生长基质O2CO2液相环境液相环境多聚赖氨酸多聚赖氨酸纤维连接蛋白纤维连接蛋白胶原胶原层粘连蛋白层粘连蛋白亲玻粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素韧粘素（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件、生长基质、生长基质（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件体外培养细胞的生长，除少数悬浮型生长的细胞外，一体外培养细胞的生长，除少数悬浮型生长的细胞外，一般需要粘附于一固相表面才能生长，这是由于在体外环境下，般需要粘附于一固相表面才能生长，这是由于在体外环境下，生存的细胞相互之间失去

58、了在体内生存时所依托的组织学关生存的细胞相互之间失去了在体内生存时所依托的组织学关系，只有附着于培养器皿的壁上生长。系，只有附着于培养器皿的壁上生长。在很多情况下，培养器皿表面的材质不太适合于某些生在很多情况下，培养器皿表面的材质不太适合于某些生长能力较差的细胞附着和生长，因而采用在长能力较差的细胞附着和生长，因而采用在培养液培养液中中添加添加或或在在培养器皿表面培养器皿表面包被包被生长基质物质生长基质物质来帮助细胞黏附、贴壁和来帮助细胞黏附、贴壁和生长。生长。在培养器皿表面在培养器皿表面包被包被的这层能改善生长表面的特性、促进的这层能改善生长表面的特性、促进细胞黏附和贴壁的物质，即细胞黏附和

59、贴壁的物质，即生长基质生长基质（growth substratum）。）。生长基质物质生长基质物质主要是一些细胞外基质成分。主要是一些细胞外基质成分。、生长基质、生长基质（五）细胞在体外生长的其它条件（五）细胞在体外生长的其它条件（1 1）多聚赖氨酸）多聚赖氨酸 （poly-lysinepoly-lysine）（2 2）纤维连接蛋白）纤维连接蛋白 （fibronectinfibronectin) )（3 3）胶原）胶原 （collagen）（4 4）层粘连蛋白）层粘连蛋白 （lamininlaminin，LNLN）（5 5）亲玻粘连蛋白）亲玻粘连蛋白 ( (vitronectinvitrone

60、ctin) )（6 6）韧粘素）韧粘素 （tenascinstenascins）主要包括：主要包括：（六）清洗和消毒（六）清洗和消毒体外培养工作需要使用大量消耗性物品，包括玻璃器皿、金体外培养工作需要使用大量消耗性物品，包括玻璃器皿、金属器械、塑料和橡胶制品以及布类纸类用品等培养用品。虽然很属器械、塑料和橡胶制品以及布类纸类用品等培养用品。虽然很多在国外基本上都采用已消毒的一次性用品，但我国目前绝大多多在国外基本上都采用已消毒的一次性用品，但我国目前绝大多数实验室因条件所限，一些培养用品仍在反复使用。因而体外培数实验室因条件所限，一些培养用品仍在反复使用。因而体外培养中大量的工作是进行清洗和消