焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法PPT学习教案

1、会计学1焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法法第1页/共24页第2页/共24页从2009年3月开始，陆续在墨西哥和美国发现人感染猪甲型H1N1流感后改为A（H1N1）疫情，目前已很多国家发现疑似病例 ，我国也确诊了两例第3页/共24页第4页/共24页第5页/共24页第6页/共24页焦磷酸测序技术分子诊断的黄金标准特异性、灵敏性远远低于病毒分离鉴定方法，可能存在假阳性反应。实时荧光实时荧光RT-PCRRTPCR测序确证遭遇瓶颈第7页/共24页Pyro + Sequencing = Pyrosequencing 焦磷酸技术 测序技术 焦磷酸测序Pyrosequen

2、cing是将焦磷酸技术应用于DNA序列分析的新一代技术分子水平上的研究最佳选择获得分子诊断的黄金标准基因序列测序焦磷酸测序用于猪流感检测的意义第8页/共24页PPiATPAPSLuciferin硫酸化酶硫酸化酶双磷酸酶双磷酸酶荧光素酶荧光素酶lighttimePyrosequencing原理原理DNADNA聚合酶聚合酶第9页/共24页l 实时和定量序列分析结果Sample sequence ：AGGCAGTTCGAC12345678910110-1 A GG C A GA GG C A G特点特点第10页/共24页l 实验设计灵活Interest regionRPKHDFPBSeq Forwa

3、rd sequencing Reverse sequencing Multiplesequencing primersInterest regionSeqRPBNNt gRcFP第11页/共24页中心理念中心理念代表各亚型代表各亚型目标序列的目标序列的比对寻找比对寻找血凝素基因血凝素基因神经氨酸酶基因神经氨酸酶基因鉴于最新爆发鉴于最新爆发H1N1甲型甲型流感病毒变异点较多，流感病毒变异点较多，特选取该株独有且变异点较为特选取该株独有且变异点较为集中的区域作为目标序列集中的区域作为目标序列 第12页/共24页PCR检测双酶切检测目的基因目的基因阳性菌测序获得阳性克隆菌BioFlux回收试剂盒回收

4、 连接与转化 RT-PCR引物设计引物设计提取模提取模板板灭活病原灭活病原 提取质粒M基因及亚型基因的质粒构基因及亚型基因的质粒构建建第13页/共24页第14页/共24页第15页/共24页第16页/共24页PCR试样预处理Pyrosequencing反应第17页/共24页开机，并拿出试剂，在使用前，保证所有试剂都达到室温混匀 磁珠，在Mixer上常温混匀10分钟，每样约3L加入结合缓冲液到50uL将50 L标记有生物素的PCR产物与50 L链霉亲和素包被的磁珠混合，在室温25 下振荡孵育20 min。用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗 30 s； 在70%乙醇中清洗5 s；变性缓冲液洗5 s；最后移到洗涤缓冲液中清洗10 s。空吸附器放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80 烘箱2 min，再冷却到室温。第18页/共24页Reagent cartridge96 well plateCCD cameraX-Y driveInk jet deliveryMixer and thermostatDetectionPositioni