黑曲霉产柠檬酸工艺条件的优化

1、生物与化学工程学院专业实验报告题目 黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化 学生姓名：学生姓名： 王一王一 专业班级：专业班级： 生物工程生物工程 2012010302 班班 学学 号：号： 1201815076 课程名称：课程名称： 发酵生产技术综合实验发酵生产技术综合实验 指导教师：指导教师： 李信义李信义 日日 期：期： 2013.6.2-2013.6.29 黑曲霉发酵产柠檬酸工艺条件的优化摘要：柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。柠檬酸又名枸橼酸,分子式为 C6H

2、8O7 ,物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，有强烈酸味，稍有涩味；极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，加热至175C 时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有 3 个 H+ 可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。 同时柠檬酸，是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。本实验研究了不同接种量、温度、PH、发酵有效体积、溶解氧对黑曲霉产柠檬酸发酵的效率，已选出最适宜黑曲霉发酵产酸的条件。关键词：黑曲霉 柠檬酸 发酵条件 优化Abstract：Citric a

3、cid is one of the main metabolites of the organism, is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is,physical properties: colorless transparent or translucent c

4、rystal, or 786OHCgranular, granular powder, although have strong sour, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175C it will d

5、ecompose to produce carbon dioxide and water, the remaining number of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 Hionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc. At the same time, citric acid, is an important industrial raw ma

6、terials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fermentation of Aspergillus niter, has to choose the most s

7、uitable fermentation conditions of Aspergillus niter.Keywords：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization 目 录1.综述 .12.实验仪器药品材料及分析方法 .12.1 实验设备.12.2 实验试剂及材料.12.3 菌株.12.4 分析方法.13.实验设计 .23.1 培养基的制备.23.2 斜面种子和液体种子的制备.23.3 温度对柠檬酸发酵的影响.23.4 溶解氧对柠檬酸发酵的影响.23.5 接种量对产柠檬酸发酵的影响.23.6 发酵液有效

8、体积对产柠檬酸发酵的影响.33.7 初始 PH 值对产柠檬酸发酵的影响.3 3.8 柠檬酸的测定.34.结果与分析 .34.1 不同初始 PH 的柠檬酸产率.34.2 不同接种量的柠檬酸产率.44.3 不同温度的产柠檬酸率.54.4 不同发酵液有效体积的产柠檬酸率.64.5 不同溶氧的产柠檬酸率.7 4.6 正交实验及结果.75.结论与展望 .8 5.1 结论.8 5.2 展望.86.参考文献 .87.感受 .901.综述 柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸。柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于自然界各种生物体中，特别是在柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃等果实中含量较

9、高，某些植物的叶子如烟叶，以及动物的肌肉、唾液中也含有柠檬酸。柠檬酸是现在以生物化学方法生产产量最大的有机酸，也是世界上应用最广泛的有机酸。因其无毒、具有温和爽快的酸味，水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品工业中，占食品酸味剂用量的 60以上。主要被用作酸味剂（与柠檬酸钠并用使酸味更加柔和，主要用于果汁、果冻、果酱、水果糖、冰棒、雪糕、食品、糕点等） 、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、风味增进剂、胶凝剂、调色剂，番茄、豆类、胡萝卜等蔬菜罐头的 pH 调节剂等。柠檬酸作为重要的食品酸味剂除了能改善食品风味外，还兼有抑制微生物生长、护色、改善黏度和流变性等作用。而且

10、在医药、饲料、化工、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域也都有十分广阔的应用。 为了给黑曲霉柠檬酸发酵创造好的条件，本实验研究了玉米粉凊液发酵的工艺条件。并为黑曲霉柠檬酸补料发酵打下了基础。本实验利用摇瓶发酵在实验室采用单因子实验和正交实验研究了黑曲霉 Wsy-03 的最佳发酵培养基组成（包括碳源，氮源） ，并对影响黑曲霉柠檬酸发酵的发酵温度、发酵初始 pH 及过程中 pH 的控制、发酵接种量进行了研究，利用小型自控发酵罐对发酵溶解氧对黑曲霉柠檬酸发酵的影响形成进行了系统研究，以寻求最优发酵培养基和发酵控制条件，同时柠檬酸的补料发酵的研究提供可靠依据和坚实基础。2.实

11、验仪器药品材料及分析方法2.1 实验设备 电子天平、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、碱式滴定管、离心机、摇床、电磁炉、酸度计。2.2 实验试剂及材料 NaOH 溶液、葡萄糖、琼脂、酚酞、玉米粉、Na2SO4、污水乙醇、蒸馏水、盐酸、碘液、-淀粉酶、甲醇、 （NH4）2SO4、MgSO4、KH2PO4。2.3 菌株 以柠檬酸主要生产菌株黑曲霉(Aspergillus niger)作为实验菌株。2.4 分析方法 通过改变发酵条件，最后测定产酸率确定各因素温度、PH、溶氧、装料系数、接种量等单因素的最佳发酵条件。本次实验通过改变温度、PH、溶氧、装1料系数、接种量等条件在摇床中发酵培养黑曲霉

12、，并最终测定柠檬酸产率确定最优发酵条件。五种单因素实验都分别取五个相邻的条件作为对比，每个条件都做三个平行实验求平均值。3.实验设计3.1 培养基制备（1）马铃薯葡萄糖培养基：将新鲜土豆洗净去皮，称取 100g 切块，加入500ml 蒸馏水，在白瓷缸中煮沸约 20min，用 8 层纱布过滤，取滤液，加蒸馏水补溶液至 500ml。将滤液继续加热，并加入 10g 葡萄糖，10g 琼脂。待琼脂融化，即可。 （2）玉米淀粉培养基：将市售玉米粉经 50 目标准分样筛处理后，取 30g玉米粉加入到 250ml 锥形瓶中，加入蒸馏水 100ml，甲醇 4.5ml， （NH4）2SO4 0.3g、MgSO4

13、0.075g、KH2PO4 0.3g，-淀粉酶 0.5g。于 70液化 15min 后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色，即糖化完全。四层纱布过滤于 250ml 三角瓶即得糖化清液。3.2 斜面种子和液体种子的制备 将冰箱保存的黑曲霉斜面菌种转接到斜面活化 PDA 培养基上，37恒温箱中培养 2-3 天，此时培养基上长满大量黑色孢子的黑曲霉菌落，即为试管斜面活化。将已灭菌好的液体种子培养基拿到无菌室进行接种，用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下 3-5 环孢子，接种到已冷却好的液体种子培养基内，包扎好后摇床 28、200r/min 培养 24h，进行种子摇床培养。3.3 温度对柠檬酸发酵的影响 在

14、无菌的条件下，用 10ml 的无菌移液管吸取 10ml 的液体种子，转入已灭菌的发酵培养基中，在 30,32,34,36，38条件下，设定转速为200r/min，发酵时间为 72h，进行摇床发酵培养。发酵完成后，测定不同的温度条件下发酵液中柠檬酸的含量，确定柠檬酸发酵的最适温度。3.4 溶解氧对柠檬酸发酵的影响 在无菌条件下，用 10ml 的无菌移液管吸取 10ml 的液体种子，转入已灭菌的发酵培养基中，在 34调节不同的转速，分别为150r/min,200r/min,250r/min,300r/min，350r/min，设定发酵时间为 72h，发酵完成后测定不同转速下发酵液中柠檬酸的含量，从

15、而确定柠檬酸发酵的最佳转速。3.5 接种量对柠檬酸发酵的影响 2 在无菌的条件下，保持其他条件不变，分别以 6%，8%，10%，12%，14%接种量吸取液体种子到发酵培养基中，在 34下，设定转速为 300r/min，发酵时间为 72h。发酵完成后测定不同的接种量条件下发酵液中柠檬酸的含量，确定柠檬酸发酵的最适接种量。3.6 发酵液有效体积对柠檬酸发酵的影响 将摇瓶发酵培养基调配至最适培养基组成及最适 pH 值后灭菌。在无菌操作下，用无菌移液管吸取 5ml,7.5ml,10ml,12.5ml.15ml 的液体种子，分别转接入已调配好的发酵培养基即 50ml，75ml，100ml，125ml，1

16、50ml 中。在 34下，设定转速为 300r/min，发酵时间为 72 小时进行发酵培养。发酵完成后，测定在不同的发酵液有效体积条件下发酵液中柠檬酸的含量，确定在最适培养基组成下的最适发酵液有效体积。3.7 初始 PH 值对柠檬酸发酵影响 调整摇瓶发酵培养基的初始 pH 值为 6.2,6.5,6.8,7.1,7.4 后进行高压蒸汽灭菌。在无菌操作下，用无菌移液管吸取 10ml 的液体种子，在 34，设定转速为 300r/min，发酵时间为 72h，发酵完成后测定不同的初始 pH 值条件下发酵液中柠檬酸的含量，确定柠檬酸发酵的最适初始 pH 值。3.8 柠檬酸的测定取 5ml 发酵液，离心取上

17、清液，精确吸取 4ml，加入 100ml 锥形瓶中，加入 2-3 滴 0.1%酚酞指示剂，用 0.1429 molL 进行滴定，滴定至微红色，平行滴定 3 次，记录平均消耗 NaOH 的体积。滴定 1ml 样品液，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH 时的溶液为 1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）4.结果与分析4.1 不同初始 PH 的柠檬酸产率 实验室内的摇床三角瓶发酵，调节合适的发酵初始 pH 值十分重要。特别是像柠檬酸发酵这种以淀粉作为发酵原料的发酵，发酵液初始 pH 的高低会直接影响到菌体糖化酶的活力，由于柠檬酸发酵是以玉米粉为原料的发酵过程，属于边糖化边生长边产酸的过程。初始

18、pH 值过低，会直接导致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同时较低发酵 pH 值，会生成亚铁氰化物，该化合物对黑曲霉菌体的生长有毒害作用。反之如果发酵液初始 pH 值较高，会使发酵过程中草酸和葡萄糖酸大量积累，使发酵液中杂酸含量过高。不同发酵液初始 pH 值对柠檬酸发酵产量的影响，见表 1、图 1。3表 1.不同初始 PH 值的柠檬酸产率初始 PH发酵液产酸率（%）6.20.126.50.176.80.237.10.217.40.18图 1. 由表 1.图 1.可以看出，黑曲霉在进行柠檬酸发酵时，只有发酵液初始 PH为 6.8 时，产酸率最高。如果发酵液初始 PH 调节过高或者过低时，都会对最后

19、的产酸率有影响。究其原因主要是，PH6.8 与糖化酶的活性最高 PH 值基本一致，如果起始 PH 低于糖化酶的作用最适范围，会使得发酵原料得不到充分利用，进而影响最终产酸率。反之如果发酵液初始 PH 过高，则黑曲霉菌丝球会出现老化现象，提前进入衰老期，如果初始发酵 PH 值更高还会引起菌体自溶。所以，发酵液初始最适 PH 值为 6.8。4.2 不同接种量的柠檬酸产率 柠檬酸发酵接种量多少，直接影响着柠檬酸发酵产酸量的多少。发酵初始接种菌丝球数量如果太少，则在发酵过程中，发酵动力不够，影响糖酸转化率。如果接入的菌丝球量太多，则菌丝球成球效果不理想，会使发酵液浓度增大，影响溶氧使产率下降。所以研究

20、发酵接种量对柠檬酸发酵产酸的影响较大，不同接种量对柠檬酸发酵产酸的影响见表 2、图 2。表 2.不同接种量的柠檬酸产率接种量（ml）发酵液产酸率（%）460.1480.19100.25120.22140.18图 2.0.00%0.10%0.20%0.30%6ml8ml10ml12ml14ml产产酸酸率率接接种种量量接接种种量量对对柠柠檬檬酸酸发发酵酵的的影影响响由表 2.图 2 可见，黑曲霉发酵柠檬酸时，接种量在 10%以下，这时产酸量会随接种量的提高而增加，但是如果发酵接种量超过 10%以上还继续增加接种量，产酸反而会随着发酵接种量的增加而降低。所以在试验中控制发酵接种量在 10%左右即可以

21、达到较好的发酵结果。4.3 不同温度的产柠檬酸率由于酶活受温度的影响也十分明显，所以合适的发酵温度对产物的积累十分重要。在柠檬酸发酵过程中，如果发酵温度过低则糖化酶的活性低，难以完成对原料的转化，使菌体生长缓慢。但是如果发酵温度过高，容易引起菌体老化过快发酵后劲不足、杂酸如草酸的积累过多等现象。不同发酵温度下发酵产酸的结果见表 3、图 3.表 3.不同温度的产柠檬酸率温度（）发酵液产酸率（%）300.13320.15340.20360.12380.10图 3.50.00%0.10%0.20%0.30%3032343638产产酸酸率率温温度度温温度度对对柠柠檬檬酸酸发发酵酵的的影影响响由表 3.

22、图 3.可以看出，发酵温度对黑曲霉产柠檬酸发酵影响较大。温度低于 34时，产酸率会随温度的升高有所提高。而当发酵温度高于 34以后，高温导致呼吸作用加强从而致使菌体形成过量，造成菌体过早进入衰老期，影响糖酸转化率。所以综合考虑菌体生长、产酸率等各个方面，黑曲霉的发酵温度应控制在 34为宜。4.4 不同发酵液有效体积的产柠檬酸率 不同的发酵液有效体积对黑曲霉菌体的生长和发育有很大的影响，从黑曲霉发酵产柠檬酸的过程分析如果发酵液有效体积过小会因营养成分不够影响菌体生长和发育，如果发酵液的有效体积过大会影响溶解氧也会影响黑曲霉的产酸率。表 4.不同有效体积的产柠檬酸率发酵液有效体积（ml）发酵液产酸

23、率（%）500.28750.251000.201250.171500.10图 4.0.00%0.10%0.20%0.30%50ml75ml100ml125ml150ml产产酸酸率率有有效效体体积积发发酵酵液液有有效效体体积积对对柠柠檬檬酸酸发发酵酵的的影影响响6 由表 4.图 4.看出，发酵液有效体积对黑曲霉发酵产柠檬酸呈反比，有效体积越大，产柠檬酸率越低。当发酵液有效体积在 50ml 的时候，黑曲霉产柠檬酸最多。其根本原因可能是装料的体积越多，发酵瓶内的体积较小，不利于菌种的发酵，导致产酸率较低。但考虑到节省成本，所以最终确定发酵液的有效体积最优的是 100ml。4.5 不同溶氧的产柠檬酸率

24、黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代谢的关键。在摇瓶发酵阶段,影响溶氧水平的主要因素就是摇瓶的转速。不同的发酵液的溶氧量对柠檬酸发酵产量的影响，见表 5、图 5.表 5.同溶氧的产柠檬酸率转速（r/min）发酵液产酸率（%）1500.102000.142500.193000.233500.25图 5.0.00%0.10%0.20%0.30%产产酸酸率率转转速速溶溶氧氧对对柠柠檬檬酸酸发发酵酵的的影影响响由表 5.图 5.结果可知,摇床转速在 350r/min 的时候黑曲霉产柠檬酸最多。由于常规摇床转速受到一定的限制,如果再提高转速,瓶内震动的过于剧烈,可能产生意外,不宜再提高速,所以在设备条

25、件有限的情况下 300r/min 是一个比较理想的搅拌速度,发酵菌可以最大程度获得溶氧。黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代谢的关键。在摇瓶发酵阶段,影响溶氧水平的主要因素就是摇瓶的转速。4.6 正交实验及结果在上述单因素实验的基础上，可知温度和溶氧对黑曲霉发酵产柠檬酸过程7有很大的影响，所以我们决定以温度和溶氧进行了正交试验。我们需特别要求在发酵过程中控制好发酵温度，其次是控制好溶氧。优化的工艺条件为 34和300r/min，最终柠檬酸的产量为 0.23%，说明该条件为最佳的发酵工艺条件。5.结论与展望5.1 结论 本文以玉米粉为原料对黑曲霉柠檬酸发酵过程进行了研究,不仅对发酵过程有了更深

26、入的认识,而且取得了良好的优化结果。 实验分别从考察温度、PH、接种量、溶氧、发酵液有效体积与产酸之间的相关特性对黑曲霉发酵过程有了初步的了解,通过对各个参数的相关性进行分析,确定了对黑曲霉发酵过程的控制策略,即在 250ml 锥形瓶中，发酵培养温度控制在34；PH 控制在 6.8、搅拌速度控制在 350r/min、接种量控制在 10%、发酵液有效体积控制在 50ml，黑曲霉产柠檬酸产率最高。5.2 展望 提高代谢产物积累的方法不胜枚取,但无外乎两方面,首先是菌种改良,特别是随着基因工程技术的发展,比如转基因技术,它在提升菌种品种方面可以菌种有质的飞跃,但是我国柠檬酸生产企业比较分散,规模有大有小,科研实力参差不齐,和西方一些国际柠檬酸生产巨头相比还有较大差距,但这并不代表传统的分离纯化已经失去了地位,相反,分离纯化目前仍然是大部分企业的基础性工作,无可替代,因为菌种经过几代培养后,各项性能都会衰退,所以必须对已经退化的菌株进行淘汰,保