原子力显微镜

1、原子力显微镜（AFM）1目录AFM的成像原理AFM用于生命科学的优势与特点AFM在细胞生物学中的应用AFM存在的问题AFM最近的研究进展总结与展望2一、AFM的成像原理原子力显微镜（Atomic Force Microscopy ，AFM），是扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy）的一种。它将一个对微弱力非常敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品并其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。3AFM的核心部分1.由针尖和微悬臂组

2、成的力传感器 针尖和样品之间的力F与微悬臂的形变d之间遵循胡克定律（Hooke Law）: F=-k d 其中，k为微悬臂的弹性系数，d为微悬臂的弯曲形变距离。 测定微悬臂形变量的大小，就可以获得针尖与样品之间作用力的大小。4AFM的核心部分2.监测微悬臂弯曲变形的光电装置5AFM的工作模式接触模式（contact mode）非接触模式（non-contact mode）轻敲模式（tapping mode）6AFM的工作模式几种力同时作用于微悬臂7二、AFM用于生命科学的优势与特点样品制备简单，对样品的破坏较其他技术（如电子显微镜）要小得多操作样品时无须导电，无须低温等真空条件能在多种环境中运

3、作，如空气、液体等，可以对活细胞进行接近实时的观察能提供生物分子的高分辨率三维图像能以纳米尺度的分辨率观察局部电荷密度和物理特性，测量生物分子之间的作用力（如受体-配体）能对单细胞、单分子进行操作（如在细胞膜上打孔、切割染色体）可以与其他分析技术或显微镜互补8三、AFM在细胞生物学当中的应用AFM对细胞膜表面形态的研究AFM检测细胞弹性以及力学性质AFM检测活细胞间相互作用AFM观察动态生物过程AFM研究生物大分子之间相互作用AFM测定细胞电学性质91、AFM对细胞膜表面形态的研究Braga PC;Ricci D Atomic force microscopy:Application to i

4、nvestigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime1998(01)Braga等在生理条件下观察了大肠杆菌受抗生素作用后的形态变化。对大肠杆菌的外膜进行观察，所获得的AFM图像清楚地显示出在大肠杆菌的外膜上有突起，其中含有成百上千个脂多糖分子LPS，也许就是这些LPS斑有效地控制着革兰氏阴性菌的外膜通透性。101、AFM对细胞膜表面形态的研究关维，纪晓龙，范丽娜，原子力显微镜对正常细胞、肿瘤细胞细胞膜表面形态结构的观察，中国实验诊断学，2006,10（9）用2%的福尔马林溶液和枸橼

5、酸盐缓冲液适制备AFM标本，观察了人成纤维细胞（Fb cell），人宫颈癌细胞（Hela cell），人乳腺癌细胞（Mcf7 cell），人成纤细胞癌变细胞（Ma-Fb）。111、AFM对细胞膜表面形态的研究关维，纪晓龙，范丽娜，原子力显微镜对正常细胞、肿瘤细胞细胞膜表面形态结构的观察，中国实验诊断学，2006,10（9）121、AFM对细胞膜表面形态的研究邢晓波，原子力显微镜研究不同刺激条件下T细胞的形态和生物力学特性，激光生物学报，2013,22(6)：496-504 （暨南大学）13静息刺激处理后2、AFM检测细胞弹性以及力学性质细胞的纳米机械性能结合其他生物物理特性(如形态学、表面围观

6、结构和纳米结构等)，可对细胞健康与否进行定性甚至定量分析，如利用AFM测量出的细胞弹性性质识别癌细胞，以及辅助诊断红细胞相关的各种疾病。由于病变与细胞的形态和力学的性质有关，利用原子力显微镜可以简便迅速的获取信息，从细胞层面上对各种疾病进行早期诊断和治疗，因此AFM探究细胞弹性在病理学研究中起着非常重要的作用。142、AFM检测细胞弹性以及力学性质赫兹模型的理论公式15式中，F为记载在微悬臂上的力；E为杨氏模量；R为针尖的曲率半径； 为泊松比，对于细胞类软样品取0.5；为下压深度。2、AFM检测细胞弹性以及力学性质Yong-xia Ding, Yuan Cheng, Mechanical ch

7、aracterization of cervical squamous carcinoma cells by atomic force microscopy at nanoscale, Med Oncol, 2015, 32:71大量研究表明，肿瘤细胞与正常细胞的杨氏模量是不同的，这说明了杨氏模量可以作为一个新的肿瘤“标记”。高分辨率的成像技术如环境扫描电子显微镜（ESEM）可以用来拍摄细胞表面的形态，来证明两者的区别。162、AFM检测细胞弹性以及力学性质Cross SE, Jin YS, Rao J, Gimzewski JK. Nanomechanical analysis of cel

8、ls from cancer patients. Nat Nanotechnol. 2007;2:7803检测了体外培养24小时的肿瘤细胞的模量，发现它们比正常细胞要柔软70%。这些肿瘤细胞是从肺癌、乳腺癌和胰腺癌病人的胸膜积液中取的。Lekka M, Laidler P, Ignacak J, abedz M, Lekki J, Struszczyk H, Stachura Z, Hrynkiewicz AZ. The effect of chitosan on stiffness and glycolytic activity of human bladder cells. BBA-Mol

9、 Cell Res. 2001;1540:12736也发现人类膀胱上皮肿瘤细胞的硬度和可变形性比正常细胞有所下降。173、AFM检测活细胞间相互作用将一种细胞连接在AFM扫描探针的尖端，使针尖功能化，对另一种单层排列的细胞进行扫描就可以进行细胞间相互作用的研究。Thie等利用AFM第一次界定了滋养细胞和子宫内皮细胞间的相互作用。Thie M, Interactions between trophoblast and uterine epithelium:monitoring of adhesive forces, Hum.Reprod. (1998) 13 (11):3211-3219.183

10、、AFM检测活细胞间相互作用Thie等利用AFM第一次界定了滋养细胞和子宫内皮细胞间的相互作用。193、AFM检测活细胞间相互作用Ramin Omidvar, Atomic force microscope-based single cell force spectroscopy of breast cancer cell lines: An approach for evaluating cellular invasion, Journal of Biomechanics 47(2014)33733379.检测细胞间的局部刚度（local stiffness）20T47D细胞被附着在包被了伴

11、刀豆球蛋白A的微悬臂上4、AFM观察动态生物过程AFM也是观察细胞生物过程的非常有效的工具。Haeberle等用AFM记录了单个病毒颗粒从被感染细胞中释放的过程。Ohnesorge以类似的方法研究了痘病毒和活细胞，得到了痘病毒感染活细胞全过程的AFM图。通过活着的细胞观察子代病毒颗粒-并用AFM在水溶液环境中在分子水平分辩出有规则重复的烙铁状结构(宽7-11nm长60-90nm,和准有序的环状结构(直径5-10nm)观察中发现在感染前后最初几小时,细胞并无显著变化;子代病毒粒子沿细胞骨架进入细胞内部,还发现了胞吐、病毒颗粒聚集等现象。2122234、AFM观察动态生物过程Yamashita H

12、, Taoka A, Uchihashi T, et al. Single-molecule imaging on living bacterial cell surface by high-speed AFM. J Mol Biol 2012;422:300-9发现了趋磁细菌细胞表面的网状结构，动力学图像揭示了在小孔边缘的颗粒是如何进出这些结构的。第一次用AFM观察到了活细胞表面的分子动力学，直接展示了孔蛋白类结构在磁性颗粒穿过细胞膜的过程。244、AFM观察动态生物过程Yokokawa M, Takeyasu K. Motion of the Ca2+-pump captured. FEB

13、S J2011;278:3025-31Yokokawa and Takeyasu将兔子肌肉中的钙离子泵提纯出来，放在云母板上的脂质环境中，用fastXY模式来检测钙离子泵运动的动力学过程。他们发现这一过程受到钙离子和ATP的共同影响。而且在一种钙离子泵抑制剂毒胡萝卜素的存在下，动力学过程被抑制。255、AFM观察生物大分子之间相互作用Protein-protein interactionsYokokawa M, Wada C, Ando T, et al. Fast-scanning atomic force microscopy reveals the ATP/ADP-dependent c

14、onformational changes of GroEL. EMBO J 2006;25:4567-76研究了细胞内与蛋白质折叠的调节相关的分子伴侣的行为。GroEL是大肠杆菌中的一种分子伴侣，而GroES被称为辅分子伴侣265、AFM观察生物大分子之间相互作用Protein-protein interactionsYokokawa M, Wada C, Ando T, et al. Fast-scanning atomic force microscopy reveals the ATP/ADP-dependent conformational changes of GroEL. EMB

15、O J 2006;25:4567-76当GroES与GroEL结合后，它诱导近端GroEL的一个构型变化，增加中心空洞的体积。当中心孔洞可以与不成熟蛋白接触时，在ATP的存在下，我们可以由AFM成像看到GroEL形成的由闭合变成开启的形式。AFM记录的数据也可以清晰显示出开启形态的GroEL比闭合的有更高(taller)的结构。275、AFM观察生物大分子之间相互作用DNA-protein interactionsGilmore JL, Suzuki Y, Tamulaitis G, et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII prote

16、in complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry 2009;48:10492-8每500ms拍摄一次，可以看出蛋白质在DNA上的结合情况286、AFM测定细胞电学性质在原子力显微镜系统中增加导电模块，在细胞样品和探针之间加一个偏压，在扫描的过程中，同时获得样品的表面形貌和电流信息，且在成像的同时检测探针和细胞样品之间的电流。296、AFM测定细胞电学性质意义：30四、AFM存在的问题1、定位精度不够高作为主流纳米位移驱动器的压电陶瓷，存在着迟滞、蠕变等非线性因素导致定位准确性较差，尤其在高速成

17、像、扫描范围较大时这些效应更为明显。31四、AFM存在的问题2、成像速度较慢由于逐点扫描成像的原理，AFM成像速度与传统显微镜相比，大幅度下降。另一方面，AFM一般采用控制与成像算法尚未达到高速扫描的要求。因此，面对纳米技术的蓬勃发展，如何提高成像速度，提升AFM的操作效率，就变成亟待解决的一个问题。32四、AFM存在的问题3、微悬臂漂移由于微悬臂本身在几何结构上的不对称，以及bimorphic construction，在长时间持续扫描的情况下，会产生漂移。4、针尖尺寸针尖尺寸越小，表面形貌越不失真，但是尺寸约小，技术难度越大。越粗糙的样品，受针尖尺寸的影响越大。33四、AFM存在的问题5、

18、分子固定技术研究动力学功能的时候，固定化就可能阻止了正常的生物活动。此外，这些过程的三维结构很难被拍摄到。因此在动力学AFM研究中，固定分子的技术有着很大的讲究，必须保证分子依然可以在空间上自由，保持接近生理学状态。34五、AFM近年来的研究进展1、AFM与超分辨率显微镜结合Jenu Varghese Chacko, Benjamin Harke, Claudio Canale, and Alberto Diaspro. Cellular level nanomanipulation using atomic force microscope aided with superresolutio

19、n imaging. Journal of Biomedical Optics 19(10), 105003 (October 2014)SR超分辨率荧光显微镜已经超越了传统的荧光显微镜，它的横向分辨率已经可以达到纳米级别。比如双色受激发射损耗（STED）显微镜。把STED与AFM结合，STED共聚焦图像相当于用作AFM移动的地图，让AFM找到目标分子或者细胞。目前，也有”随机光学重建显微镜”（STORM）与AFM配合的，可以达到单分子水平的图像。35Suzuki, Y， High-speed atomic force microscopy combined with inverted opt

20、ical microscopy for studying cellular events，Scientific Reports, 3 : 2131 | DOI: 10.1038 JUL 4 2013最大的区别就是该课题组用的是固定在微悬臂上的探针探针在XY方向扫描 ,而不是样品在XY方向扫描。这就意味着，样品可以被放到透明的基底上，用荧光或者可见光去研究，用倒置的光学显微镜去看。36五、AFM近年来的研究进展2、高速AFM近年来采用响应速度更快的压电驱动器，来提升AFM的扫描速度。Georg Schitter通过重新设计扫描器结构，从机械机构上降低水平方向振动对竖直方向的耦合影响，进而提高了高

21、速扫描时的成像精度。日本金泽大学则使用三块压电陶瓷分别控制样品台三个方向上的运动，取代了运动耦合误差较大的管式扫描器，实现了对活性蛋白的连续成像。37五、AFM近年来的研究进展3、解决微悬臂漂移问题纽约州立大学Chiara Spagnoli, Arthur Beyder, Stephen R. Besch, and Frederick Sachs，Drift-free atomic force microscopy measurements of cell height and mechanical properties. REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS 78

22、我们开发了一种软件路径，来消除微悬臂在持续扫描样品获得力对距离曲线的过程中产生的漂移。Stick-and-Move(SaM) Routine 首先扫描细胞表面的兴趣位置，再扫描基底上的位置信号代表了两个峰，一个是接触基底，一个是接触细胞。用Python语言进行数据分析之后，可以在细胞位置的峰上减去基底的峰。384、Long-Tip AFMShibata M, Long-tip high-speed atomic force microscopy for nanometer-scale imaging in live cells, Scientifc Reports, DOI: 10.1038 2015 Mar