实验二、福林酚试剂法测定测定蛋白质的含量

1、实验二、Folin酚法测定蛋白质的含量一、原理 可溶性蛋白与Folin酚试剂反应， Folin酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色复合物，蓝色的深浅与蛋白质的含量呈正比。因为蛋白质中含有酚基的氨基酸。根据蓝色深浅测定消光值即可求出可溶性蛋白质的含量。 这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。五种蛋白质测定方法比较如下： 方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，

2、适用 于 0 . 2 1.0mg氮，误差为 2费时 810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双 缩 脲 法（Biuret法）灵敏度低120mg中速 2030分钟多肽键碱性Cu2紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100g快速 510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin酚试剂法（Lowry法）灵敏度高5g慢速 4060分钟 双缩脲反应；磷钼酸

3、磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高15g快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 此法可检测的最低蛋白质量达5g。通常测定范围是20250g 二、材料和试剂二、材料和试剂 1、标准蛋白质 250ug/ml 牛血清白蛋白溶 于重蒸水溶液 2、Folin酚试剂甲 A0.2MNaOH+4%NaCO3 等体积混合 配100ml B2

4、%酒石酸钾钠+1%CuSO4.5H2O 等体积混合 配10 ml 当天使用时混合有效A 100ml+B 2ml 3、 Folin酚试剂乙 吸取5ml苯酚+5mlMNaOH滴定至酸浓度为1M 附：乙试剂配制方法：附：乙试剂配制方法： 在 2 升 磨 口 回 流 瓶 中 ， 加 入 1 0 0 克 钨 酸 钠(Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却

5、后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 4、 分光光度计 5、恒温水浴锅 6、蛋白质样品溶液 A：鸡蛋清白蛋白 100-250ug/ml 的重蒸水 B：土豆 取样品用水冲洗干净，用纱布擦干，立即称取1-5g鲜样，置研钵中加重蒸水少许及石英沙，研磨成匀浆，过滤弃去残渣，定容至50 ml,滤液经6000 r/min离心30分钟，取上清液待测。五、 操作 1、标准曲线制作：ml标准蛋白液于带塞小试管，分别加入不同量的蒸馏水到1ml ，各加5ml ml

6、试剂乙，立即混匀，25左右反应30分钟，于500nm波长下测定消光值，以OD500为纵坐标，含量为横坐标，绘出标准曲线，（浓度低时可用OD750nm） 2、样品测定ml样品液加5ml ml试剂乙，立即混匀，25左右反应30分钟，于OD500nm波长下测定消光值，从标准曲线上查出蛋白质的浓度。注意注意：1、因Folin酚试剂反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫

7、升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定吸光值。每分钟测一个样品。2、Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。当Folin酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。3、样品稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释。六、结果 1、标准曲线 2、样品蛋白质浓度Folin酚试剂法实验表格酚试剂法实验表格： 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250g/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约200g/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.