药物分析与检验：第六章 酶法分析

1、 第六章 酶法分析 生命科学学院制药工程酶基本理论1酶分析法2酶法分析3生物传感器与酶传感器4本章内容第一节 酶基本理论1 酶是一类特殊的催化剂。2 酶具有特殊性（1）催化效率高（2）专一性强3 酶易受外界因素影响 相对专一性 绝对专一性 旋光异构专一性 立体异构专一性4 酶反应动力学 米氏方程：反映酶反应速率与底物浓度之间定量关系。 VmS Km+S V：一定底物浓度s时，测得的反应速率 Km：米氏常数 Vm：底物饱和时最大反应速率 当V=1/2Vm时，Km=S V= 酶分析法：以酶为分析对象，根据需要对生物药物生产过程中所使用的 酶和生物药物样品所含的酶进行酶的含量或酶活力的测定。 酶法分

2、析：以酶为分析工具或分析试剂，用于测定生物药物样品中用一般化学方法难于检测的物质，如底物、辅酶、抑制剂和激动剂或辅助因子含量的方法。第二节 酶分析法一、酶促反应条件酶活力：酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位（U）：指在25 条件下，以最适底物浓度，最适缓冲液离子强度以及最适pH值等条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量为一个活性单位。酶比活力（ U/mg ）：表示毎毫克酶所含有酶活力单位。底物：选用底物物理、化学性质与产物不同，易于测定，保证足够底物浓度。pH值：改变酶活性中心解离状况，影响酶活性。温度：影响化学反应和酶稳定性。辅助因子：金属离子抑制剂和激活剂二、酶促反应条件 一、酶法分析

3、的检测方法 （一）紫外-可见分光光度法 原理：根据产物和底物在紫外-可见光区有明显的特征吸收差别。脱氢酶辅酶NAD(P)H在340nm附近吸收高峰，氧化型NAD(P)没有。细胞色素氧化酶底物细胞色素C还原时550nm摩尔吸收为2.18104，氧化型为0.8104。（二）荧光分析法 原理：如果酶反应底物或产物有荧光，可根据荧光变化速度作为酶反应速度。脱氢酶辅酶NAD(P)H中性溶液发强蓝白色荧光，氧化型NAD(P)没有。（三）旋光度法 反应过程中伴随旋光变化。第三节 酶法分析 一、酶法分析的检测方法（四）氧电极法 原理：利用氧化酶和加氧酶在催化底物反应时用溶解氧作为辅助试剂，反应中所消耗的氧量用

4、氧电极测定。（五）酶电极法 原理：固定化酶和电极结合在一起构成酶电极，利用酶催化反应产生电流变化。（六）放射性同位素测定法 原理：用同位素标记酶，与底物反应生成放射性产物，测定产物同位素含量。二、酶法分析的分析方法 一、终点测定法（一）原理：先借助酶反应使被测物质定量地进行转变，转化完成后，测定底物产物或辅酶物质等变化量。最普遍，最广泛的酶法分析方法。 1 满足条件： （1）要有高度专一酶 （2）确定酶反应进行完全的条件 （3）底物减少，产物量增加以及辅酶变化易测定2 终点法条件：酶对底物特异性反应平衡：酶催化反应是可逆反应 偏向逆方向解决方法： （1）除反应产物 （2）双底物反应可以提高第二

5、底物浓度 （3）与不可逆的酶反应偶联促进产物转化为反应物 （4）采用不同平衡常数辅酶类似物反应液酶量反应产物抑制作用（二）终点测定法种类 1 单酶反应测定法（1）利用底物量的减少测定法条件：底物完全转化为产物，底物可以直接测定胆红素，胞嘧啶，腺嘌呤等（2）产物量的增加测定法 以待测物为底物酶的反应条件：底物完全转化为产物，产物可以直接测定氨基酸类，草酸等。（3）辅助酶变化量测定NADH,NADPH340nm特征吸收峰，NAD,NADP无特征吸收峰。2 酶偶联测定法 采用两种或两种以上的酶进行连续式或平行式的反应。被偶联的酶起指示剂作用称为指示酶。常用NAD,NADP脱氢酶。过氧化物酶和氧化酶偶

6、联。 二、反应速率法（一）原理：在一定条件下（pH，T）测定反应的初速率，而反应的初速率与被测物质的浓度成正比关系。动力学测定法：在反应体系中加入一定量的酶，测定反应物，产物速率变化。（二）反应速率法 1 利用待测物质作底物的测定法 一定pH值温度下，待测物质作为底物，其余物质过剩，保证反应初速率与被测物质浓度成正比。 2 利用待测物质作辅酶或抑制剂的测定方法 如果待测物质可以作为某种酶专一的辅酶或抑制剂，通过测定反应速率进行物质定量测定。 3 特殊反应速率测定法三、酶循环放大分析法（一）原理： 1 转换反应 以样品中待测物质为底物，经特异反应生成与待测组分相当的定量循环底物。 2 循环反应

7、生成的循环底物反复参加由两个酶反应组成的偶联反应，所得产物为循环底物的若干倍。 3 指示反应 采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数计算出循环底物量，再推算试样中待测物质的量。（二）酶循环反应类型 底物循环，氧化酶和脱氢酶系统 底物循环，脱氢酶和辅酶系统 辅酶循环第四节 生物传感器与酶传感器一、原理：待测物质经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别后，利用生物反应产生的信息被相应的化学或物理换能器转变成可定量和课处理的电信号，再经二次仪表放大输出，计算待测物质浓度。 分子识别元件：酶膜、全细胞膜、免疫膜等信号转换器：电化学转换器、声波检测器等二、分类：1 根据传感器输出信号产生方式（1）生物亲和型生物传感器 待测物与分子识别元件作用后，产生物理变化，电荷，厚度，温度。（2）催化型生物传感器 以底物消耗，产物增加作为输出信号。2 根据分子识别元件： 酶传感器，组织传感器，细胞器传感器等。3 根据生物传感器的信号转化器：电化学生物传感器，热敏电阻，测热型生物传感器。三、酶传感器（一）利用某一种酶对某种被测定化合物专一催化作用。把生物酶涂布在离子选择性电极传感膜上，酶与待测物质作用产生相应离子，通过转换器进行电流、