双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立

1、双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立摘要 建立了双功能试剂 2-( 4-异硫氰基苯基) 甲基 -1 ， 4，7，10-四氮杂环十二烷 -1，4，7，10-四乙酸( p-SCN-Bn-DOTA) 与标准肽段反应的新方法，测定了反应产物与镧系金属 Eu 的螯合效率，探索了其作为靶向探针和蛋白定量标记试剂性 能。考察了不同缓冲体系的浓度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量与肽段相对量、反应体系中有机相与水相比例，反应温度与 反应时间对偶联效率的影响。 实验结果显示： p-SCN-Bn-DOTA 量为肽段的 32倍，缓冲体系为 0.2 mol/L TEAB (pH 8.5)， 60C反应60

2、 min ,有机相与水相之比为 4.4 : 1 (V/V)时标 记效率高；在HCI/NaAc缓冲体系(pH 4.0)中60C反应60 min , 金属离子鳌合反应效率高达94%。本研究建立了一种新的基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA勺标记方法，并成功用于 RGD 肽等的标记。关键词 双功能试剂； 标记； 多肽； 蛋白定量； 质 谱2015-10-03 收稿； 2016-03-11 接受本文系北京市自然科 学基金( Nos. 7143172， 7143173)资助E-maiI： shenjing691 引 言 双功能试剂连接多肽并螯合金属元素，可以作为靶向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向

3、治疗研究1 ，还可以通过标记多种金属元素制备蛋白质组学多重定量试剂 2 ，用于 肿瘤标志物的筛选、鉴定、分类等研究。因此双功能试剂在 肿瘤研究方面具有良好的应用前景。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) 序列的短肽，基于靶向多肽RGD进行放射性核素标记可用于 a VB 3 ( +)肿瘤的无创性检查以及判断患者是否适用于抗 肿瘤血管形成治疗35。此外，标记的小分子多肽具有生 物相容性好、穿透性强、免疫原性低、作用快、易于实时监 测的特点，可在基于靶向探针的蛋白的分析检测方面发挥独 特优势 6， 7。在肿瘤蛋白质组定量分析研究方面，目前已开发的方法有基于稳定同位素标

4、记的方法，如ICAT8 180酶切标记9、SILAC10 、iTRAQ 11等，但这些方法普遍存在同位素价格 昂贵、标记难度较大、对质谱分析仪器具有选择性、同位素 峰在质谱分析时会发生相互干扰等缺点，会给定量结果带来 误差12。因此探索非同位素标记的方法，开发具有我国自 主知识产权的蛋白定量试剂具有重要意义。文献 1315报 道了针对肽段半胱氨酸标记设计的金属编码亲和标签。徐明 等16利用外源Hg标签标记硒蛋白/多肽，实现Se-Hg双元 素标记选择性识别和检测硒蛋白 /多肽。但是在实际的蛋白质 组学样本分析中，需要使用适用于所有肽段的标记方法。 Liu 等17开发了基于双功能试剂二乙酸胺五乙酸

5、的标记方法， 实现了肽段的无歧视标记，但所选择的双功能试剂标记效率 不高。针对此问题， Wang 等18 用羟基琥珀酰亚胺 -四氮杂 环十二烷四乙酸( DOTA-NHS-ester) 作为螯合试剂进行了初 步研究， 在此基础上， 文献 12 ，19对标记方法进行了优化， 提高了金属标记效率。虽然非同位素标记的方法已取得了进展，但是仍有以下 几方面需要改进。首先， DOTA-NHS-ester 容易水解，在反应 体系中， 活化酯与 NH2 的标记反应和水解反应互相竞争， 不 利于反应体系中水相和有机相组成的确立。 其次，肽段中 NH2 与 DOTA-NHS-ester 是亲核取代反应， 反应体系

6、应在中性或偏 碱性条件进行；而 DOTA-NHS-ester 在碱性条件下极易水解， 水解产生酸， 在一定程度上改变反应体系的pH 值20 。因此，DOTA -NHS-ester的水解敏感性高不利于确立标记反应条件， 对实际样本分析条件的限制很大，因此优化双功能试剂的意 义重大。2-(4-异硫氰基苯基)甲基 -1， 4， 7， 10-四氮杂环十二 烷-1, 4, 7, 10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOT)是一种被广泛应 用的双功能螯合试剂，如与牛血清白蛋白(BSA)和鸡蛋清溶菌酶标记可用于肿瘤的检测 21,与利妥昔单抗 22或核糖 核酸 23反应标记可以用于抗肿瘤药的生物分布和显影的研究,

7、还可以与聚乙二醇 24标记得到胶束用于制剂研发等。 它的化学结构较 DOTA-NHS-ester稳定，不易发生水解反应， 这对于标记反应条件的确立十分有利，并可以通过螯合金属 离子标记氨基多肽。基于 p-SCN-Bn-DOTA的标记方法的建立 不仅有望开发一种新型的金属标记试剂，用于肿瘤蛋白质组 学的多重定量分析，而且可将该试剂用于 RGD肽的标记，从 而有利于肿瘤受体显像剂的开发。本研究建立了基于双功能 试剂p-SCN-Bn-DOTA的螯合金属元素标记多肽新技术，并成 功标记RGD等标准肽段。2 实验部分2.1 仪器与试剂Ultraflex II 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALD

8、I-TOF-MS,德国布鲁克公司）；Discovery DV215CD分 析天平（美国OHAUS公司）；HQ-60涡旋混匀器（北方同正 生物技术发展有限公司） ； PMC-060 掌上离心机 （日本 TOMY 公司）。a -氰基-4-羟基肉桂酸（德国布鲁克公司）；标准合成肽 段LGEYGFQNALIV由吉尔生化（上海）有限公司合成；RGD肽由北京中海康医药科技发展有限公司合成；三乙二胺碳酸 盐（TEAB、氯化铕（EuC 13）（美国 Sigma-Aldrich 公司）； p-SCN-Bn-DOTA（美国 Macrocyclics公司）；其它试剂均为国 产分析纯；实验用水为 Milli-Q（美国

9、Millipore公司）超纯水。2.2 实验方法2.2.1 p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段的偶联反应100卩L0.5 卩 moL p-SCN-Bn-DOTA溶 于二甲基甲酰胺（DMF）, 50 卩 L 0.68卩moL肽段LGEYGFQNALIV溶于TEAB将两种溶液 以不同比例混合进行偶联反应，考察TEAB的浓度和pH值、DOTA与肽段的摩尔比、反应温度、反应时间等条件对偶联 效率的影响。其中肽段的终浓度始终为0.05 nmol/卩L。称取RGD肽 1 mg, 加 DMF 124 卩 L, 供 p-SCN-Bn-DOTA与 RGD 肽的偶联反应。2.2.2 偶联产物与金属离子的螯合反应

10、向2.2.1中的反应体系加入 5卩L 0.1 mol/L EuCI3溶液（盐酸 -乙酸钠缓冲液或乙酸 -乙酸铵缓冲液） ，再分别加入相 应的不同pH值的缓冲液50卩L,考察pH值、反应温度、 反应时间对螯合效率的影响。2.2.3 MALDI-TOF-MS分析 （1）干点法点样 取1卩L分 析样品点于 Ground steel 靶板上， 自然干燥后， 再点 5 mg/mL CHCA基质溶液（0.1%TFA-50%乙腈溶液）1卩L,自然干燥后 进行质谱分析。（2）薄层法点样 先在靶板上点0.5卩L CHCA 基质的乙醇过饱和溶液，自然干燥后，再点1卩L CHCA基质溶液（ 5 mg/mL， 0.1

11、% TFA-50% 乙腈溶液）和样品的混合溶 液。采用 Peptide Calib standard mono 作为标准品校正，相 对标准偏差w 5 ppm。质谱数据采集采用反射模式。仪器控 制软件为 FlexControl software verion 3.0 ，数据处理软件为FlexAnalysis software verion 3.0 。3 结果与讨论3.1 双功能试剂的选择 目前针对巯基的金属元素标记方法较多，标记氨基的金 属元素标记方法研究较少，已有的标记N-端氨基的方法有转 氨法等，如先将蛋白的游离 N-端氨基转化为活性的羰基，然后与连有肼的荧光基团反应得到标记分子 25 。氨

12、基的金属 标记，理论上可以标记所有的肽段，对所有的肽段和蛋白质 （含巯基和不含巯基的） 都能进行定量研究 2， 20， 26， 27。 p-SCN-Bn-DOTA是一种双功能螯合试剂，可与肽段的氨基共 价结合，并通过络合反应螯合金属离子，与Wang 等18采用的DOTA-NHS-ester相比，其结构稳定，不易水解，既能够 明确反应体系中水相和有机相的比例，又有利于确定反应体 系的 pH 值，这些均利于标记反应条件的确立。3.2 金属元素和标准肽段的选择p-SCN-Bn-DOTA可与多种稀土金属离子形成螯合物，其 中与镧系金属离子形成的螯合物稳定性最佳 28 ，故选镧系 金属离子 Eu 作为螯

13、合标签。标准肽段的选择应具有典型性，由于实际的生物样本大 多是通过胰酶酶解成肽段，肽段C端是精氨酸（R）或者赖氨酸（K），故选用常用的标准蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解 肽段LGEYGFQNALIV作为标准肽段之一；RGD肽由于在肿瘤 诊断和治疗中的重要意义而被选作为标准肽段。3.3 肽段的金属元素标记反应原理 肽段的金属元素标记反应的原理如图 1 所示，首先是肽 段的氨基与p-SCN-Bn-DOTA发生共价反应，反应产物再与镧 系金属元素形成稳定螯合物。以产物和反应物的 MALDI-TOF-MS质谱峰峰面积计算标 记反应的效率，标记效率（ %）= 产物峰面积 /（产物峰面积 +原肽峰面积）X 1

14、00%。3.4 p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段偶联反应的优化341缓冲体系对p-SCN-Bn-DOTA标记反应的影响 考察 了 3种缓冲体系NaHCO3-Na2CO3体系、DMF-三乙胺体系以 及三乙二胺 TEAB体系。对于0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3缓冲 液（pH 8.8）,由于反应产物盐浓度过高，需要稀释50倍以上才能被MALDI-TOF检测到，而且钠盐是不可挥发性盐，Na+ 对质谱可能产生的干扰不易去除。Scheinberg 等29将p-SCN-Bn-DOTA与肽段GGGFC在无水的DMF -三乙胺体系中 反应，但是实际的生物样品酶解产物是含水的体系，因此纯 有机

15、溶剂的DMF-三乙胺体系不适用于生物样品酶解产物分 析。而TEAB是可挥发性碳酸盐，p-SCN-Bn-DOTA与肽段 LGEYGFQNALIVRm/z 1479）可以在 TEAB缓冲体系中反应生 成标记产物（ m/z 2031 ），而且结晶状态好，适合质谱检测， 因此，选择TEAB体系进行后续实验条件优化。342 p-SCN-Bn-DOTA的量与肽段量的比例、反应温度、 反应时间对标记反应的影响 由于标记反应中影响标记效率 的因素众多30 , 31，本研究考察了 p-SCN-Bn-DOTA量与肽 段量的比例、 反应温度、 反应时间等因素， 结果如表 1 所示。 由表1可见，p-SCN-Bn-D

16、OTA和肽段的摩尔比为 32倍，在60 C 反应 60 min 时， 标记效率最高， 因此选择上述条件为最佳反 应条件。与文献 20 报道的 DOTA-NHS-ester 50倍过量于肽段、 肽段的终浓度为0.125 nmol/卩L相比，本方法反应试剂的用 量少，而且适用的肽段的浓度更低，显示出更高的标记灵敏 度。肽段和标记产物的质谱图如图2 所示。3.4.3 反应体系中有机相与水相比例的考察 实验条件优化过程中，为保证肽段的终浓度一致，需要改变有机相和 水相的比例来实现其它参数的调整。实验过程中发现，在一 定范围内，反应体系中水的比例越高，标记效率越低，最佳有机相与水相之比为 4 ： 15

17、: 1 (V/V)。3.4.4 缓冲体系浓度及 pH 值对反应的影响 缓冲体系浓 度及 pH 值是影响螯合剂配位能力的主要因素。本研究考察了 0.1 ，0.2 和 0.5 mol/L TEAB 缓冲溶液在 pH 值分别为 6.5，7.5， 8.5， 9.5 时 DOTA 与肽段的偶联效率，用三乙胺和冰醋 酸调节 pH 值。结果表明， 缓冲体系为 0.2 mol/L TEAB， pH 8.5 的条件下偶联效率较高，且重现性好。3.5 p-SCN-Bn-DOTA与 RGD肽的偶联反应按照221节实验方法制备 RGD肽，在优化的条件下， 即缓冲体系为 0.2 mol/L TEAB（ pH 8.5），

18、与 p-SCN-Bn-DOTA 在60 C进行偶联反应60 min ,实验结果如图3所示，标记 效率为 90.6%。3.6 反应温度、反应时间及 pH 值对螯合反应的影响对于EuCI3与DOTA偶联产物的标记反应，分别考察了乙酸铵-乙酸（HAc-NH4Ac），盐酸-乙酸钠（HCI-NaA。反应 体系；反应温度为 30C, 60C和100C；反应时间为15和60 min ; pH值为4.0和5.5时的标记效率。结果如表 3及图 4所示，其中在pH 4.0的HCI-NaAC缓冲液中，60C反应60 min 标记效率最高，而且酸性条件下（ pH 4.0），可以减少金 属离子和肽段的非特异性结合。3.

19、7 MALDI 检测方法的考察对用于 MALDI 检测的样品点样方法进行了考察， 比较了 干点法和薄层法两种方法。如图 5 所示，结果显示干点法相 对较好，结晶状态均匀，样品检测灵敏度高。4 结论本研究通过双功能试剂 p-SCN-Bn-DOTA与RGD等标准肽 段反应，考察与镧系金属元素 Eu 螯合效率，对螯合稀土金 属标记肽段的反应条件进行了优化。p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段反应的条件为： DOTA 为肽段的 32倍，缓冲体系为 0.2 mol/L TEAB, pH 8.5,反应温度60C,反应时间为60 min ;偶联产物与金属离子反应的条件为：pH 4.0的HCI/NaAC缓冲体

20、系中反应60 min。MALDI-TOF检测时样品点样方法使用干点 法较好。本研究结果表明，p-SCN-Bn-DOTA在标记RGD等多 肽上有良好的应用，有望成为一种新的高灵敏度金属标记试 剂和肿瘤受体显像剂。References1 Lee S， Xie J， Chen X. Chem. Rev，. 2010， 110（ 5）： 3087-31112 Kerr T J， McLean J A. Chem. Commun.， 2010， 46（30）：5479-54813 Ang C Y， Tan S Y， Zhao Y. Org. BiomoI. Chem，. 2014， 12（ 27）： 4

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