实验碱性磷酸酶米氏常数的测定

1、实验五实验五 碱性磷酸酶米氏常碱性磷酸酶米氏常数的测定数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（km）及最大反应速度（vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的km 和vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1原理2主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸（3）比较吸光度的比值 纯dna8 . 1280260nmnmaa（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1原理beer-l

2、ambert（比尔）定律： t=i/i0 a=lg1/t=lgi0/i a=kcl其中：t为透光率；a为吸光率；i0为入射光强度；i为透射光强度；k为吸收系数；c为溶液浓度；l为溶液光程的厚度 2常用方法（1）标准曲线法 od或浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法 cx/ax=cs/as，已知cs，测定as、ax，可求得cx。（3）摩尔吸光系数法c=a/（为l=1cm，c为1 mol/l时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-s曲线 v s推导出米氏方程为：其中s为底物浓度；v为初速度；vm为最大反应速度；km 为米氏常数 sksvvmm米氏常数k

3、m是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定km和vm，可通过作图法求得。 最常用的lineweaver-burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/s作图，可得一条直线mmmvsvkv111 1/v 1/vm -1/km 1/s本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pnpp)水解的km和vm.反应式：pnpp+h2o pnp+hpo42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pnp的含量，求出反应速度v。 三、试剂与器材三、试剂与器材试剂： 0

4、.5mol/ml pnp 、10 mmol/l pnpp、20 mmol/l mgcl2、0.1 mol/l 碳酸钠碳酸氢钠 ph 10.1缓冲液、0.1 mol/l naoh、6 g/ml碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计四、分光光度计的使用 1722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定”键（mode）：用于设置测试方式“100%t/0abs”键：用于自动调整100.0%t(100.0透射比)或0abs(零吸光度)“0%t”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要

5、使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按“0%t”键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%t”调100%透射比 按“方式键”（mode）将测试方式设置为吸光度方式(a) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%t”调零a 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。返回返回返回五、操作方法五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号,0号一支,17

6、号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pnp含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/ml pnp (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 h2o (ml) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 na2co3-nahco3 (ml) 各管加入1.0 ml 20 mmol/l mgcl2 (ml) 各管加入0.2 ml 0.1 mol/l naoh (ml) 各管加入2.0 ml od 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，od405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。

7、求出pnp的克分子消光系数()值。(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。no. 1 2 3 4 5底物终浓度s (mm ) 0.5 0.75 1.0 1.5 310 mmol/l pnpp（ml ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6蒸馏水（ml ） 0.5 0.45 0.4 0.3 0 碳酸盐缓冲液（ml ） 各加1.0 ml 20 mmol/l mgcl2 （ml ） 各加0.2 ml 预热 混匀，37，5分钟酶液（ml ） 测定管各加0.2 ml酶液 反应时间 37，精确反应10分钟0.1 mol/l naoh（ml） 各加2 ml 酶液（ml ）

8、空白管各补加0.2 ml酶液 od405（三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的od值(od405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以moll-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/s作图，求出酶催化pnpp水解的米氏常数km和最大反应速度vm。六、 注意事项1. 取液量一定要准确。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加naoh，后加酶。5.测定od405时要以各自的空白调零点。6.移液管或取液器的使用7.比色杯的使用返回管号1122 33 44 55 加酶时间（min）0.511.522.533.544.55加naoh时间10