(分子生物学本科生课件)细胞培养

1、( (分子生物学本科分子生物学本科生课件生课件) )细胞培养细胞培养基本条件细胞培养室：清洁的无菌间（紫外灯消毒）仪器设备：超净工作台（配有刻度吸管，酒精灯，移液器，废液缸）， 二氧化碳培养箱，二氧化碳钢瓶，（荧光）倒置显微镜，液氮 灌，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，离心机，滤器（过滤培养基）, 细胞计数器试剂：血清，培养基（1640，DMEM等)，PBS，胰酶（或EDTA)，抗菌素器皿：铝饭盒，培养瓶，培养皿，6孔板，24孔板，96孔板，水桶细胞株：贴壁，悬浮动物细胞培养的特殊性动物细胞培养的特殊性1 1、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。 2、动物细胞对于营养要求更加苛刻

2、，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。 3、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。 4、动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。 培养细胞的生存环境1.环境无毒和无菌；2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（19959975pa）和CO2（95空气+5%CO2）；pH7.2-7.44.渗透压；260320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质；六碳糖

3、是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等细胞培养方法原代培养：细胞第一次贴壁，未成细胞系 有组织块法，胰酶消化法（单细胞）传代培养：细胞从培养瓶上脱离，第二次再贴壁；或消化后再贴壁培养基：含10%血清培养液（完全培养基）+抗菌素 （常用1640，DMEM)冻存：在液氮中长期储存（缓慢），-20度1小时，-80度过夜，液氮 DMSO占10%+含一瓶细胞的10%血清培养基占40%+血清占50%=1ml 冻存管复苏：液氮中取出后快速复温（37度水浴），减少震动细胞运输：无菌技术所有器皿需要高压灭菌操作需要无菌培养基过滤除菌胰酶过滤除菌培养基中加入抗菌素细胞离心：速度800-1000转/分

4、换液与传代：2-3天换液一次（培养液变黄），2-4天传代一次（细胞长满）细胞污染培养基变浑浊废弃，清理孵箱防止细胞交叉污染：更换吸管防止细胞交叉污染：更换吸管细胞培养的应用细胞培养的应用体外观察基因的功能体外观察基因的功能检测细胞增殖能力：MTT, BrdU, EdU, 流式细胞术检测细胞凋亡：检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法， 检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法 原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法 细胞迁移能力：划痕实验，Bydens Chamber细胞侵袭能力：Transwell侵袭实验细胞恶性表型：软琼脂克隆形成能力基因转染：研究基因过表达或沉默后对细胞的影响 瞬时 稳定单克隆抗体制备单克隆抗体制备有两种方法： 第一种方法是：增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化； 第二种也是最普遍采用的方法是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集510ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高