第七章发酵生产染菌及其防治

1、第七章第七章 发酵生产染菌及其防治发酵生产染菌及其防治纯种培养要求必须防止杂菌污染纯种培养要求必须防止杂菌污染为防止染菌，采取了一系列措施：为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、严格的无菌操菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、严格的无菌操作、改进生产工艺等。作、改进生产工艺等。 染菌无法彻底避免；染菌无法彻底避免；据报道，国外抗生素发酵染菌据报道，国外抗生素发酵染菌率为率为25%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为菌率为2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为为5%，谷氨

2、酸噬菌体感染率为，谷氨酸噬菌体感染率为12 染菌对发酵产率、质量、三废治理都有很大的影响。染菌对发酵产率、质量、三废治理都有很大的影响。 发酵染菌后，一定要发酵染菌后，一定要找出染菌的原因找出染菌的原因，以总结防治，以总结防治发酵的经验教训，且积极采取必要的措施，防止生发酵的经验教训，且积极采取必要的措施，防止生产过程中染菌，把染菌消灭在发生之前。产过程中染菌，把染菌消灭在发生之前。一、染菌对不同发酵的影响一、染菌对不同发酵的影响 青霉素：产青霉素酶的杂菌青霉素：产青霉素酶的杂菌 疫苗：全部废弃疫苗：全部废弃 柠檬酸：主要防止前期染菌柠檬酸：主要防止前期染菌 谷氨酸：噬菌体危害大谷氨酸：噬菌体

3、危害大 肌苷、肌苷酸：易染菌肌苷、肌苷酸：易染菌第一节第一节 染菌对发酵的影响染菌对发酵的影响 二、染菌发生的不同时期对发酵的影响二、染菌发生的不同时期对发酵的影响（1）种子培养期染菌种子培养期染菌：发现种子染菌应：发现种子染菌应灭菌灭菌后弃去后弃去，并对，并对种子罐、管道进行检查和彻种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。底灭菌。（2）发酵前期染菌发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。（3）发酵中期染菌：）发酵中期染菌： 发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大；发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大； 抗生素发酵抗

4、生素发酵： 将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施低流加糖量等措施 柠檬酸发酵柠檬酸发酵： 污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低ph，抑，抑制细菌生长；制细菌生长； 污染酵母污染酵母 ：加：加0.025-0.035g/l硫酸铜；硫酸铜； 污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使ph下降，黄曲霉自溶下降，黄曲霉自溶 污染青霉：青霉能在低污染青霉：青霉能在低ph环境下生长，可

5、考虑提环境下生长，可考虑提前放罐。前放罐。（4）发酵后期染菌）发酵后期染菌 产物积累较多，营养物即将耗尽。如染菌量不大，产物积累较多，营养物即将耗尽。如染菌量不大，可继续发酵；如污染严重可考虑提前放罐。可继续发酵；如污染严重可考虑提前放罐。 四、染菌程度对发酵的影响四、染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大。对发酵的危害越大。 如果生产菌已在发酵液中占优势，污染少量杂菌，如果生产菌已在发酵液中占优势，污染少量杂菌，对发酵不会造成太大的影响。对发酵不会造成太大的影响。 前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。前期

6、和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。 第二节第二节 发酵染菌的途径分析发酵染菌的途径分析（一）发酵染菌后的异常表现（一）发酵染菌后的异常表现 罐温异常升高罐温异常升高 发酵液发酵液ph异常变化异常变化 溶解氧及溶解氧及co2水平异常水平异常 菌丝黏度的异常变化菌丝黏度的异常变化 发酵液气味的异常变化发酵液气味的异常变化 发酵液中碳、氮含量的异常变化发酵液中碳、氮含量的异常变化 发酵液中产物量的异常变化发酵液中产物量的异常变化 泡沫异常泡沫异常 菌体太浓或太稀菌体太浓或太稀二、染菌的检查与判断二、染菌的检查与判断1、染菌的检查、染菌的检查（1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）：）显微镜检查

7、法（最简单、最直接、最经常）：观观察微生物的形态特征，检查是否有与菌种形态特征不察微生物的形态特征，检查是否有与菌种形态特征不一样的其他微生物在存在。一样的其他微生物在存在。（2）平板划线培养或斜面培养检查法；）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温平板制好后，应先保温24小时，确定无菌；划线后分小时，确定无菌；划线后分别于别于37、27培养，一般培养，一般24h后镜检是否有杂菌。后镜检是否有杂菌。（3）肉汤培养基检查法）肉汤培养基检查法（酚红变色（酚红变色ph6.8-8.4） 样品直接接入灭菌的肉汤培养基中，分别于样品直接接入灭菌的肉汤培养基中，分别于37、27培养，随时观察，

8、并取样镜检。培养，随时观察，并取样镜检。 噬菌体检测时，用双层平板法，底层为肉汤培养噬菌体检测时，用双层平板法，底层为肉汤培养基，上层琼脂减量，指示菌为生产菌。基，上层琼脂减量，指示菌为生产菌。 无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续（红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落，可判断染菌。三次发现有异常菌落，可判断染菌。 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，经镜检等其它方法确的各项参数确有可疑染菌，经镜检等其它方法确认连续

9、三次样品有相同类型的异常菌存在，也可认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也可判断为染菌。判断为染菌。 无菌实验的肉汤或平板应保存并观察至本批放罐无菌实验的肉汤或平板应保存并观察至本批放罐后后12h12h，确认无菌后才能处理。无菌试验期间应每，确认无菌后才能处理。无菌试验期间应每6h6h观察一次无菌试验样品。观察一次无菌试验样品。三、发酵染菌原因分析三、发酵染菌原因分析发酵的染菌率发酵的染菌率（指一年内发酵染菌批数与总（指一年内发酵染菌批数与总投料批数之比）投料批数之比）发酵染菌批数发酵染菌批数总投料批数总投料批数总染菌率总染菌率 100染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、染菌率与发酵的菌种

10、、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。平等有关。染菌原因分析染菌原因分析u 染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。然。u 主要染菌原因：主要染菌原因：种子带菌种子带菌，无菌空气带菌无菌空气带菌，设设备渗漏备渗漏，灭菌不彻底灭菌不彻底，操作管理不当。操作管理不当。（一）染菌的杂菌种类分析（一）染菌的杂菌种类分析 杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角） 杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等）设备渗漏，

11、管理操作等） 杂菌是真菌（可能是设备或冷却盘管渗漏、杂菌是真菌（可能是设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当）无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当）（二）染菌的规模分析（二）染菌的规模分析 大批量发酵罐染菌大批量发酵罐染菌：种子、空气：种子、空气； 前期前期：种子带菌，灭菌问题；种子带菌，灭菌问题； 中后期中后期：空气带菌；空气带菌； 部分发酵罐染菌：部分发酵罐染菌：前期（种子染菌、连消系统灭菌前期（种子染菌、连消系统灭菌不彻底）；后期（可能是中间补料染菌）不彻底）；后期（可能是中间补料染菌） 个别发酵罐连续染菌：个别发酵罐连续染菌：大都是由于设备渗漏大都是由于设备渗漏（三）染菌的时间分

12、析（三）染菌的时间分析 种子培养阶段：种子培养阶段：种子、灭菌、接种操作或设备因素；种子、灭菌、接种操作或设备因素； 发酵前期：发酵前期：种子、灭菌、接种操作、空气带菌等；种子、灭菌、接种操作、空气带菌等； 发酵后期：发酵后期：空气、补料、设备渗漏、泡沫顶盖、操空气、补料、设备渗漏、泡沫顶盖、操作问题作问题第三节第三节 杂菌污染的途径和预防杂菌污染的途径和预防一、种子带菌的防治一、种子带菌的防治 种子带菌原因：种子带菌原因： 斜面菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、斜面菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移接种过程染菌和种子培养设备装置污菌种子转移接种过程染菌和种子培养设备装置污菌等。等。种

13、子带菌的防治方法：种子带菌的防治方法：（1）严格控制无菌室的污染，交替使用多种方法）严格控制无菌室的污染，交替使用多种方法对无菌室灭菌。对无菌室灭菌。（2）制备种子时对砂土管、斜面、三解瓶及摇瓶）制备种子时对砂土管、斜面、三解瓶及摇瓶均要严格管理，防止杂菌进入。均要严格管理，防止杂菌进入。（3）对每一级种子严格进行无菌检查，确保任何）对每一级种子严格进行无菌检查，确保任何一级种子未受杂菌感染。一级种子未受杂菌感染。（4）培养基及用具灭菌要彻底，高压灭菌时要完）培养基及用具灭菌要彻底，高压灭菌时要完全排净冷空气应防止假压全排净冷空气应防止假压,达到不到所需的温度；达到不到所需的温度；二、空气带菌

14、及其防治二、空气带菌及其防治空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。二、空气带菌及其防治二、空气带菌及其防治措施：从空气净化流程和设备设计、过滤介措施：从空气净化流程和设备设计、过滤介质的选用和填充灭菌和管理方面完善，加质的选用和填充灭菌和管理方面完善，加强卫生管理，减少含菌量，正确选择采风强卫生管理，减少含菌量，正确选择采风口，设计合理工艺，加前置粗过滤器、降口，设计合理工艺，加前置粗过滤器、降低空气湿度、保持过滤介质干燥、防止空低空气湿度、保持过滤介质干燥、防止空气冷却器漏水等气冷却器漏水等三、操作失误导致染菌及防治三、操作失误导致染菌及防治 主要指培养基和设备

15、灭菌不彻底主要指培养基和设备灭菌不彻底 原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；措施：措施：可可升温前搅拌和加淀粉酶。升温前搅拌和加淀粉酶。 麸皮、黄豆饼等固形物溅到罐内各种支架上，堆麸皮、黄豆饼等固形物溅到罐内各种支架上，堆积不易彻底灭菌。措施：预先配料积不易彻底灭菌。措施：预先配料 实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。温时，应打开排气等阀门放气。 灭菌中产生泡沫，严重时可升至罐项，泡沫内带灭菌中产生泡

16、沫，严重时可升至罐项，泡沫内带菌，温度低于灭菌温度，导致存活。措施：措施菌，温度低于灭菌温度，导致存活。措施：措施消泡剂，严防泡沫升顶。消泡剂，严防泡沫升顶。 连续灭菌时，温度和时间要符合要求。蒸汽压力连续灭菌时，温度和时间要符合要求。蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。底。四、设备渗漏或四、设备渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防造成的染菌及其防止止 设备渗漏设备渗漏：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等

17、形成微小漏孔后发生渗漏染菌。不良等形成微小漏孔后发生渗漏染菌。“死角死角”：由于操作、设备结构、安装及其他人为因：由于操作、设备结构、安装及其他人为因素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、空气分布管、发酵罐部件、管件等。空气分布管、发酵罐部件、管件等。 常见的设备、管道常见的设备、管道“死角死角” 发酵罐的发酵罐的“死角死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢发酵罐罐底脓疱状积垢。 管道安装不当形成的死角管道安装不当形成的死角五、噬菌体污染和防治五、噬菌体污染和防治 噬菌体是细菌病毒，可通过环境污染、设

18、备渗漏噬菌体是细菌病毒，可通过环境污染、设备渗漏或或“死角死角”、空气系统、培养基灭菌、补料过程、空气系统、培养基灭菌、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。及操作过程等环节进入发酵系统。 利用细菌或放线菌发酵的生产易受噬菌体的污染，利用细菌或放线菌发酵的生产易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，较由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，较难防治，对发酵有很大威胁。难防治，对发酵有很大威胁。噬菌体污染症状噬菌体污染症状 氨基酸发酵中，光密度不上升或回降；氨基酸发酵中，光密度不上升或回降；ph逐渐上逐渐上升，可到升，可到8.0以上；氨的利用停止；糖耗、升温缓以上；氨的利用停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫；慢或停止；产生大量泡沫； 谷氨酸产量少，甚至找不到完整的菌体，谷氨酸产量少，甚至找不到完整的菌体，co2排排出量异常；出量异常； 发酵周期延长；发酵周期延长； 发酵液泡沫多、难中和取分离困难，收率低。发酵液泡沫多、难中和取分离困难，收率低。（1）、噬菌体的防治）、噬菌体的防治 是一项系统工程，从培养基制备灭菌、种子培是一项系统工程，从培养基制备灭菌、种子培养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道等诸多养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道等诸多方面，具体归纳如下：方面，具体归纳如下： 严格活菌体排放，切断噬菌体的来源严格活菌体排放，切断噬菌体的来源