Westernblot实验步骤ppt课件

1、Western blot 实验技术 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663Western blot Western blot 原理原理oWestern Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分别蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分别的蛋白质被到转移到固相支撑物NC膜，PVDF膜等上后，固相载体以非共价键方式吸附蛋白质，且能坚持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反响，再与酶标志的二抗体起反响，经过底物显色以检测特异蛋白质表达程度。o由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目

2、前该技术也被广泛运用于蛋白质表达程度的检测。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663Western Blot Western Blot 信号放大根本原理信号放大根本原理 经过SDS-PAGE分别的蛋白质、多肽等被转移到固相支持膜上，然后用蛋白质或多肽特异性的抗体来检测 一级信号放大一级信号放大二级信号放大二级信号放大一抗抗原抗原一抗二抗 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663Western BlotWestern Blot普通流程普通流程底片扫描、分析底物显色二抗孵育一抗孵育封锁转膜SDS-PAGE电泳蛋白样品的制备 辉骏生物：fitge

3、ne/ 免费效力热线：400-699-1663Western BlotWestern Blot根本实验步骤根本实验步骤1 1、蛋白质提取：、蛋白质提取：WIPWIP或或RIPARIPA裂解细胞或研磨组织，离心，搜集上清。裂解细胞或研磨组织，离心，搜集上清。2 2、蛋白定量：先总蛋白定量，、蛋白定量：先总蛋白定量，westernwestern后在根据内参定量。后在根据内参定量。3 3、电泳：根据需求检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。、电泳：根据需求检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。4 4、转膜：半干或湿转，运用半干法转膜需防止短路。、转膜：半干或湿转，运用半干法转膜需防止短路。5

4、 5、封锁：、封锁：5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA封锁过夜或室温封锁过夜或室温1 1小时。小时。6 6、一抗孵育：、一抗孵育：5%5%脱脂奶粉稀释一抗到适宜的浓度，与膜室温孵育脱脂奶粉稀释一抗到适宜的浓度，与膜室温孵育1 1小时或小时或4 4度过夜，度过夜，1x TBST1x TBST洗膜洗膜3 3次，每次次，每次5 5分钟。分钟。7 7、二抗孵育：、二抗孵育：5%5%脱脂奶粉稀释二抗到适宜的浓度，与膜室温孵育脱脂奶粉稀释二抗到适宜的浓度，与膜室温孵育1 1小时，小时， 1x TBST1x TBST，洗膜，洗膜3 3次，每次次，每次5 5分钟。分钟。8 8、显影、显影(ECL(ECL

5、法法) )：将：将A A、B B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，封锁胶盒，根据所见荧光强度曝膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，封锁胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立刻完全浸入显影液中光。取出胶片立刻完全浸入显影液中1-2min1-2min，清水漂洗一下后放在定，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。9 9、图片分析：标定、图片分析：标定MarkerMarker，进展分析与扫描，进展分析与扫描 。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1

6、663o贴壁细胞：细胞可以在培育皿里裂解，洗掉培育基，贴壁细胞：细胞可以在培育皿里裂解，洗掉培育基，PBSPBS洗洗2323次，次，参与参与RIPARIPA裂解液裂解，以可以将细胞消化下来，离心，裂解液裂解，以可以将细胞消化下来，离心，PBSPBS洗洗2323次，参与次，参与RIPARIPA冰上裂解液裂解冰上裂解液裂解3030分钟可提高蛋白浓度。按分钟可提高蛋白浓度。按6 6孔孔板板100-200100-200微升微升/ /孔的比例参与孔的比例参与PIPA(PIPA(可根据细胞多少调理裂解液体可根据细胞多少调理裂解液体积积, 4, 4度，度，1200012000转，离心转，离心1515分钟，搜

7、集上清分钟，搜集上清. .o悬浮细胞悬浮细胞: : 搜集培育细胞，离心去除培育液，用搜集培育细胞，离心去除培育液，用PBSPBS洗洗2-32-3遍，按遍，按6 6孔板参与孔板参与100-200100-200微升微升/ /孔的比例参与孔的比例参与RIPARIPA，用抢悬浮细胞。假设，用抢悬浮细胞。假设细胞数量较大，应按细胞数量较大，应按50-10050-100万细胞万细胞/ /管分装或根据细胞数量按比例管分装或根据细胞数量按比例添加添加RIPARIPA的用量，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。的用量，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。4 4度，度，1200012000转，离心转，离心1515分钟，搜集上

8、清分钟，搜集上清. .o组织样品：液氮研磨组织，按每组织样品：液氮研磨组织，按每2020毫克组织加毫克组织加100-200100-200微升的比例微升的比例参与参与RIPA,RIPA,冰上裂解冰上裂解3030分钟，分钟，4 4度，度，1200012000转，离心转，离心3030分钟，搜集上分钟，搜集上清清. .蛋白样品的制备蛋白样品的制备 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663蛋白样品的定量蛋白样品的定量 Bradford Bradford法测定蛋白浓度法测定蛋白浓度原理：此法基于考马斯亮蓝原理：此法基于考马斯亮蓝G-250G-250有红、蓝两种不同颜色的方式。有红

9、、蓝两种不同颜色的方式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反响迅速而稳定。反响化合蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反响迅速而稳定。反响化合物在物在595nm595nm处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。的高低成正比关系。考马斯亮兰溶液的配制：称取考马斯亮兰溶液的配制：称取100mg100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250溶于溶于50mL95%50mL95%乙醇，参与乙醇，参与100mL85%(W/V)100mL85%(

10、W/V)磷酸，将溶液用水稀释到磷酸，将溶液用水稀释到1000mL1000mL，过滤。试剂的终浓度为过滤。试剂的终浓度为0.01%0.01%考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250，4.7%(W/V)4.7%(W/V)乙醇，乙醇，和和8.5%(W/V)8.5%(W/V)磷酸。磷酸。实验步骤：实验步骤：9696孔板，对照孔板，对照20l PBS,20l PBS,测定蛋白样品测定蛋白样品:18l+2l:18l+2l蛋蛋白，参与白，参与200l200l考马斯亮兰溶液，放置考马斯亮兰溶液，放置2 2分钟在一个小时内分钟在一个小时内测，时间变长，能够会产生沉淀，酶标仪上测，时间变长，能够会产生沉淀，酶标仪上5

11、95nm595nm处测定吸处测定吸光值，这样只能相对定量蛋白，假设要定量蛋白，可以用不同光值，这样只能相对定量蛋白，假设要定量蛋白，可以用不同梯度的梯度的BSABSA做规范曲线来定量蛋白做规范曲线来定量蛋白 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：原理： SDS SDS 是一种阴离子外表活性剂是一种阴离子外表活性剂. .当当 SDS SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时, ,它会以它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, ,而以硫酸根而以硫酸根离子外露与水

12、分子作用离子外露与水分子作用. .大多数蛋白质和大多数蛋白质和 SDS SDS 的平均结合量是的平均结合量是 1:1.4 (1:1.4 (以分量为单位以分量为单位),),而蛋白质结合固定比例之而蛋白质结合固定比例之 SDSSDS后后, ,由于由于 SDS SDS 带强负价带强负价, ,使蛋白质原先的带电价微缺乏道使蛋白质原先的带电价微缺乏道, ,且每单位分量之蛋白质且每单位分量之蛋白质带电价一致带电价一致 (charge density),(charge density),所以决议不同蛋白的泳动速率就只所以决议不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项要素。剩下分子大小一项要素。 辉骏生物：fit

13、gene/ 免费效力热线：400-699-1663SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳留意： 1一切蛋白样品定量一致，体积以一致，不够的用裂解液补满，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样，Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积，这样可以防止最边上的孔道电泳时出现分散，使最边上的孔道电泳出现误差。 2Western Blot普通上样30100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开场摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。 3浓缩胶的目

14、的使得loading 的样品可以在同一条程度线上进入分别胶 ，假设电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分别胶。而在分别是实际上小电压长时间分别的效果会更好，浓缩胶80v，分别胶100v就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，防止稀释上层的分别胶，使胶不均匀。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663转膜转膜PVDFPVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理：膜和硝酸膜结合蛋白的原理： 普通而言，硝酸纤维素膜是经过疏水作用来和蛋白质相联，反普通而言，硝酸纤维素膜是经过疏水作用来和蛋白质相联，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差，背景

15、相对叫弱。复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差，背景相对叫弱。 尼龙膜主要经过它膜上的正电荷和蛋白接合注：常用的尼龙膜主要经过它膜上的正电荷和蛋白接合注：常用的PVDFPVDF即带正电荷的尼龙膜，同时也有疏水作用，但相对较弱，即带正电荷的尼龙膜，同时也有疏水作用，但相对较弱，PVDFPVDF膜和蛋白接合较牢，不易零落，结果较好，但背景相对叫强。膜和蛋白接合较牢，不易零落，结果较好，但背景相对叫强。分类：分类： 半干法和湿法转移是两种不同的转移安装下的转移系统，将膜，半干法和湿法转移是两种不同的转移安装下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在胶，滤纸整个浸泡在bufferbuffer的的TankT

16、ank里转移的，叫湿法；用滤纸吸里转移的，叫湿法；用滤纸吸bufferbuffer来做转移体系的叫半干法。来做转移体系的叫半干法。BIO-RADBIO-RAD的半干转运系统的弱点的半干转运系统的弱点就是无法控温，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸就是无法控温，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。水性比较差的情况下，就很容易烧胶。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663转膜转膜 半干实验步骤：半干实验步骤： 先将先将PVDFPVDF膜在甲醇中浸泡约膜在甲醇中浸泡约30s,30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分在放入转膜缓冲液

17、里浸泡数分钟。每块胶用钟。每块胶用60mA60mA，1h1h，从下到上的顺序：阴极，从下到上的顺序：阴极/ /滤纸滤纸/PVDF/PVDF膜膜/ /凝凝胶胶/ /滤纸滤纸, , 凝胶面向阴极，坚持潮湿和没有气泡。必要时可先用丽凝胶面向阴极，坚持潮湿和没有气泡。必要时可先用丽春红染色春红染色2%2%乙酸，乙酸，0.5%0.5%丽春红的水溶液察看蛋白条带转移到丽春红的水溶液察看蛋白条带转移到膜上的效率。膜上的效率。 湿转实验步骤：湿转实验步骤： 将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，100V100V稳压转膜稳压转膜1.51.5小

18、时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进小时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进展相应调整，转膜后丽春红染色展相应调整，转膜后丽春红染色2%2%乙酸，乙酸，0.5%0.5%丽春红的水溶液丽春红的水溶液察看蛋白条带转移到膜上的效率。察看蛋白条带转移到膜上的效率。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663原理：原理： 脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封锁膜，防止标志抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白经过锁膜，防止标志抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白经过疏水作用

19、与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜经过疏水作疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜经过疏水作用结合而产生很高的背景。用结合而产生很高的背景。种类：种类： 常用的封锁液有常用的封锁液有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20gelatin, tween-20等等, ,普通用普通用non-fat milk.non-fat milk.实验步骤：实验步骤： 5%5%脱脂奶粉用脱脂奶粉用1x TBS1x TBS配制，或配制，或1xTBST1xTBST配制封锁过夜配制封锁过夜 或室温或室温1212小小时。时。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663一抗、二抗孵育1 1：原理：原理： 一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二抗可与一抗结合，同时二一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二抗可与一抗结合，同时二抗上带有特异的酶如辣根过氧化物酶抗上带有特异的酶如辣根过氧化物酶HRPHRP，碱性磷酸酶法，碱性磷酸酶法AP,AP,化学发化学发光显色法光显色法HRP ),HRP ),此酶可以分解底物使胶片感光。此酶可以分解底物使胶片感光。2 2：实验步骤：实验步骤