第二章10基因工程基因文库的构建

1、第六部分第六部分 基因文库的构建基因文库的构建一、基因文库的概述一、基因文库的概述二、基因组二、基因组dna文库的构建文库的构建三、三、cdna文库的构建文库的构建1、基因文库、基因文库(gene library)概念概念是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称又称dna文库。文库。基因文库由外源基因文库由外源dn

2、a片段、载体和宿主细胞片段、载体和宿主细胞组成。组成。一、一、基因文库的概述基因文库的概述2 2、基因文库的分类、基因文库的分类 基因组基因组dnadna：提取的染色体基因组提取的染色体基因组dnadna。如果要研究。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在的是控制基因表达的调控序列，或是在mrnamrna中不存中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组体基因组dnadna中获得。中获得。 cdnacdna：mrnamrna反转录成的反转录成的cdna cdna 。如果研究的目标是。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以

3、根据克隆的弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cdnacdna分子的核苷酸序列直接推导出来。分子的核苷酸序列直接推导出来。 基因组文库（基因组文库（genomic librarygenomic library）含有全部基因。）含有全部基因。 cdnacdna文库（文库（cdna librarycdna library）含有全部蛋白质编码的）含有全部蛋白质编码的结构基因。结构基因。 用用鸟枪法鸟枪法构建基因组文库，材料来自构建基因组文库，材料来自染色体染色体dna。 用用cdna法法构建构建cdna文库，材料来自文库，材料来自mrna。 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段在高度

4、分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的的mrna种类不同（种类不同（即基因的表达谱不同即基因的表达谱不同），因此同），因此同种生物体的种生物体的cdna文库一般还有组织细胞的界定，如文库一般还有组织细胞的界定，如肝肝组织组织cdna文库文库或或胚胎组织胚胎组织cdna文库文库等。很显然，等。很显然， cdna文库的信息量远小于基因组文库。文库的信息量远小于基因组文库。(1)(1)基因组文库基因组文库(genomic library)(genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组是指将某种生物体的全部基因组dnadna用限制性内切用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的

5、酶或机械力量切割成一定长度范围的dnadna片段，再片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。因组文库。 目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。部基因。 基因组文库根据基因组文库根据dnadna来源分为：核基因组文库、叶来源分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库、线粒体基因组文库。绿体基因组文库、线粒体基因组文库。 克隆外源克隆外源 dna片段的切割主要采用片段的切割主要采用机械断裂或限机械断裂或限制

6、性部分酶解制性部分酶解两种方法，其基本原则：两种方法，其基本原则：dna 片段之间存在部分重叠序列。片段之间存在部分重叠序列。dna 片段大小均一。片段大小均一。(2) cdna(2) cdna文库文库 (cdna library) (cdna library) ： 是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mrnamrna经反转录形成的经反转录形成的cdnacdna片段与某种载体连接而形成的片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。克隆的集合。 cdna(complementary dnacdna(complementary dna，互补，互补dna)dna

7、)：是由生物的：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mrnamrna经体外经体外反转录后形成的互补反转录后形成的互补dnadna。 基因组文库与基因组文库与cdnacdna文库的最大区别：文库的最大区别： 基因组文库含有而基因组文库含有而cdnacdna文库不含有文库不含有非转录的基因组非转录的基因组序列。序列。2021-10-2163 3、构建基因文库的基本方法、构建基因文库的基本方法将特定生物体的因组将特定生物体的因组dnadna或或cdnacdna分解成适当大小分解成适当大小的的dnadna片段片段, ,然后分别与克隆载体连接成重组然后分别与克隆

8、载体连接成重组dnadna分子。分子。通过转化或转导的方法将带有不同通过转化或转导的方法将带有不同dnadna片段的重片段的重组组dnadna分子导入受体细胞，获得一套包含特定生分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有物体所有dnadna序列的克隆。序列的克隆。二、基因组文库的构建二、基因组文库的构建( (一一) )基因组文库的类型基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。体文库等）。( (二二

9、) )基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数n n之之间的关系可用下式表示：间的关系可用下式表示：n = ln ( 1 p ) / ln ( 1 f )（三）基因组（三）基因组dnadna文库的质量标准文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组dnadna文库应具备下列条件：文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的

10、压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分 隔克隆。隔克隆。 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以 利于克隆排序。利于克隆排序。 克隆片段易于从载体分子上完整卸下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。( (四四) )基因组文库构建的一般步骤基因组文库构建的一般步骤 载体的选择和制备。载体的选择和制备。 高纯度、大分子量基因组高纯度、大分子量基因组 dna dna 的提取。的提取。 基因组基因组 dna dna 的部分酶切与分级分

11、离。的部分酶切与分级分离。 载体与载体与dnadna片段的连接。片段的连接。 转化或侵染宿主细胞。转化或侵染宿主细胞。筛选鉴定基因组及保存。筛选鉴定基因组及保存。 载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的文库构建的载体载体通常选通常选装载量较大的装载量较大的l l-dna-dna或考斯质粒；对于大型基因或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和组（如动植物和人类）需使用人类）需使用yacyac或或bacbac载体载体由于绝大多由于绝大多数真核生物的数真核生物的mrnamrna小于小于10 kb10 kb，因此用于，因此用于cd

12、nacdna文库构文库构建建的载体通常选质粒或的载体通常选质粒或l l-dna-dna 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下： 用于基因用于基因文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因组基因组dnadna的制备的制备 为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性， 用于用于基因组基因组文库构建的文库构建的dnadna在分离纯化操作中应尽量避免过在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的度的断裂。制备的dnadna分子量越大（至少是插入片断大分子量越大（至少是插入片断大小的小的3 3

13、5 5倍），文库的重组率和完备性也就越高。倍），文库的重组率和完备性也就越高。 用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体dnadna的长度一般在的长度一般在100 kb100 kb左右左右 如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有sdssds蛋白酶蛋白酶k k、rnasearnasea的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得 100 kb100 kb大大小的小的dnadna片段。片段。aaaa基因组基因组dna的切割的切割 用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的dna片段的切割一般采用超声片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶

14、切两种方法，其目的是：波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：保证保证dna片段之间存在部分重叠区。片段之间存在部分重叠区。保证保证dna片段大小均一。片段大小均一。 超声波处理后的超声波处理后的dna片段呈平头末端，需加装人工接片段呈平头末端，需加装人工接头。头。 部分酶切法一般选用部分酶切法一般选用4碱基识别序列碱基识别序列的限制性内切酶，的限制性内切酶，如：如：sau3a或或mboi等，这样等，这样dna酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的dna片段必须根据载体的装载量片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的进行分级分离，以杜绝不

15、相干的dna片段随机连为一片段随机连为一体！体！载体与载体与dnadna片段的连接片段的连接在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，大量体系连接前大量体系连接前先使用先使用小体系连接来寻找最佳比例！小体系连接来寻找最佳比例！方法一：粘末端连接方法一：粘末端连接方法二：人工接头法方法二：人工接头法转化或转化或侵染侵染宿主细胞宿主细胞在基因组在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效文库的构建过程中，最好选择转化效率高的。率高的。进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！（五）基因组文库构建的技术性问题（五）基因组文库构建的技术性问题在基因组在基因组

16、文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是： 严禁外源严禁外源dnadna片段之间的连接！片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的dnadna片段根据载体的装载量分级分离。片段根据载体的装载量分级分离。 用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去dnadna片段的末端磷酸基团。片段的末端磷酸基团。 在在dnadna片段的末端添加人工接头片段的末端添加人工接头 。（六）构建基因组文库应注意的问题（六）构建基因组文库应注意的问题构建一个文库，插入构建一个文库，插入dnadna

17、和载体和载体dnadna的质量是成功的质量是成功与否的关键。基因组与否的关键。基因组dnadna应当非常纯以适应应当非常纯以适应dnadna的的酶解，而且基因组酶解，而且基因组dnadna也应足够大（最好超过也应足够大（最好超过200kb200kb）以获得两个末端的消化产物。）以获得两个末端的消化产物。 不论是载体不论是载体dnadna还是靶还是靶dnadna不含外源片段是一个基不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组dnadna将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。被鉴定

18、为所要的克隆。 部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别个碱基的限制酶要比识别6个碱个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的不够高而导致产生的dna片段末端不能有效地片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和dna浓度及纯度。浓度及纯

19、度。 在考虑把在考虑把噬菌体臂和插入噬菌体臂和插入dna片段连接过程中有两片段连接过程中有两个重要参数：个重要参数：噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组组dna的浓度和纯度。大约的浓度和纯度。大约10pg噬菌臂和噬菌臂和4gdna能产生有效地包装。对一个典型的基因组要产生一个能产生有效地包装。对一个典型的基因组要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于可表达文库，重组子数一般要大于11066l06。 包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。年多。而在而在-70中只能保存几星期，而且包装效率还会降中只能保存几星期，而且包装效

20、率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如性包装抽提物，例如gigapack（stratagene），都），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装噬菌体噬菌体dna和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。（七（七) )原核生物基因组文库的构建原核生物基因组文库的构建1 1、原核生物基因组的提取、原核生物基因组的提取染色体染色体dnadna质粒质粒dnadna要求：制备的要求：制备的dnadna的长度为的长度为100-200kb100-200

21、kb。防止在制备过程中的机械断裂。防止在制备过程中的机械断裂。2 2、酶切片段与载体连接、酶切片段与载体连接酶切片段及分离、纯化酶切片段及分离、纯化基因组的不完全酶切基因组的不完全酶切 根据实验需要选择合适的限制性内切酶根据实验需要选择合适的限制性内切酶 四个识别位点的限制酶出现的几率四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256: 1/256 六个识别位点的限制酶出现的几率六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024: 1/1024 分离目的酶切片段大小的确定分离目的酶切片段大小的确定 克隆单个基因：克隆单个基因： 10 kb 10 kb 克隆基因族：克隆基因族： 20kb 20kb dna

22、dna不完全酶切条件的确定不完全酶切条件的确定 确定限制酶用量，改变酶切时间确定限制酶用量，改变酶切时间 固定酶切时间，改变限制酶的用量固定酶切时间，改变限制酶的用量dnadna的不完全酶切的不完全酶切酶切片段回收酶切片段回收低熔点琼脂糖回收目的片段低熔点琼脂糖回收目的片段试剂盒回收目的片段试剂盒回收目的片段酶切片段与克隆载体连接酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择：克隆载体的选择： 质粒载体可承载质粒载体可承载15kb dna15kb dna左右片段左右片段 l l载体可承载载体可承载25kb dna25kb dna左右片段左右片段 cosmid cosmid 载体可承载载体可承载45kb

23、dna45kb dna左右片段左右片段3 3、重组、重组dnadna转化受体细胞转化受体细胞根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞：常见的宿主细胞：dh5dh5 、hb101hb101、jm101jm101、jm109jm109重组质粒转化受体细胞重组质粒转化受体细胞 1 1）转化法）转化法(transformation)(transformation) 2 2）转染法）转染法(transfection)(transfection) 3 3）转导法）转导法(transduction)(transduction)4、基因组、基因组dna文库克隆子

24、保存与筛选文库克隆子保存与筛选基因组基因组dna文库的保存文库的保存文库在液体培养基中扩增保存文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长混合的细菌生长数代后数代后，其培养物于，其培养物于-80储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。中某些特定的序列过多或过少。保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上

25、挑选方法：从平板上挑选单个克隆子单个克隆子接种于合适的含接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为入终浓度为25%25%的甘油，于的甘油，于-80-80保存。保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。 基因组文库的筛选基因组文库的筛选 表型筛选法：表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选。表达性状易于鉴别，如互补筛选。 抗性筛选法：抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄。如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄。 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长。二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生

26、长。 分子杂交法：分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选。利用分子探针对文库进行筛选。 免疫筛选法：免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交利用多肽等作为抗原进行原位杂交 筛选。筛选。 pcrpcr筛选法：筛选法：根据保守序列合成引物根据保守序列合成引物, ,扩增特异性扩增特异性 片段。片段。从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知识密切相关。目的基因的背景知识包括：识密切相关。目的基因的背景知识包括：目的基因的部分或全部碱基序列已知。目的基因的部分或全部碱基序列已知。目的

27、基因编码产物的结构或功能已知。目的基因编码产物的结构或功能已知。目的基因与某些生物表型的相关性已知。目的基因与某些生物表型的相关性已知。(八八)用用噬菌体载体构建基因组文库的步骤噬菌体载体构建基因组文库的步骤 准备载体准备载体dna(如置换型如置换型噬菌体载体噬菌体载体)，用适当，用适当的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右的限制性内切核酸酶消化并分离得到载体的左右两臂。两臂。 纯化真核细胞高分子质量纯化真核细胞高分子质量dna，并用适当的限，并用适当的限制性内切核酸酶部分消化。制性内切核酸酶部分消化。 分离适当大小的基因组分离适当大小的基因组dna片段片段(20-24kb)。 连接载体与

28、外源连接载体与外源dna。 连接产物体外包装及感染。连接产物体外包装及感染。 基因组文库的扩增。基因组文库的扩增。基因组文库基因组文库限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组dnadna基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装三、三、cdnacdna文库构建文库构建真核生物基因组大，结构复杂，含有大量的非真核生物基因组大，结构复杂，含有大量的非编码区、内含子和重复序列等，直接利用基因编码区、内含子和重复序列等，直接利用基因文库很难分离得到目的基因。即使分离到文库很难分离得到目的基因。即使分离到dna片段，也要同片段，也要同cdna序列进行比较。序列进行比较。 mrna是基因转录加工后的产物

29、，且只在特定是基因转录加工后的产物，且只在特定组织器官和发育时期表达。因此，从组织器官和发育时期表达。因此，从cdna克克隆文库分离基因更具优势。此外，隆文库分离基因更具优势。此外，mrna决定决定了功能蛋白质的初始肽链的翻译，可以用来研了功能蛋白质的初始肽链的翻译，可以用来研究蛋白质的功能。究蛋白质的功能。(一一)cdna文库的特征文库的特征 从从cdna文库获得的是已经过剪接、去除了内含子的文库获得的是已经过剪接、去除了内含子的cdna,它不含真核基因的间隔序列及调控区它不含真核基因的间隔序列及调控区, 只反映只反映mrna的分子结构，并不是真正意义上的基因。的分子结构，并不是真正意义上的

30、基因。 cdna文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因。文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因。 基因总量少，显然比基因组基因总量少，显然比基因组dna文库小得多，很容易文库小得多，很容易从中筛选克隆得到细胞特异表达基因。从中筛选克隆得到细胞特异表达基因。 cdna文库是有时效性的，文库构建时的信息供体是文库是有时效性的，文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总某一时空条件下的细胞总mrna，它是在转录水平上，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或或器官器官)在某种环境条件下的基因表达情况并不能包括在某种环境条件下的基因表达

31、情况并不能包括该生物有机体的全部基因，不同物种、不同组织的该生物有机体的全部基因，不同物种、不同组织的cdna文库不同。文库不同。(二二)cdna文库的用途文库的用途 cdna文库可作为研究功能基因组学的基本手段。文库可作为研究功能基因组学的基本手段。cdna便于克隆和大量表达便于克隆和大量表达,因此可以从因此可以从cdna文库中筛文库中筛选到所需的目的基因选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。并直接用于该目的基因的表达。 cdna文库也可用于保护濒危珍稀生物资源，提供构建文库也可用于保护濒危珍稀生物资源，提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，可用于分离全长基因，分子标记连锁图谱的所用

32、探针，可用于分离全长基因，进而开展基因功能的研究。进而开展基因功能的研究。 cdna在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，在个体发表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有广泛的应用价值。等生命现象的研究中具有广泛的应用价值。(三三)cdna文库构建的步骤文库构建的步骤细胞总细胞总rna的提取和的提取和mrna的分离的分离第一链第一链cdna合成合成第二链第二链cdna合成合成双链双链cdna的

33、分级分离的分级分离双链双链cdna克隆进质粒或噬菌体载体并导入克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖宿主中繁殖重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1、细胞总、细胞总rna的提取和的提取和mrna的分离的分离mrna的来源的来源:选用选用mrna含量高的组织材料，或通过药物等含量高的组织材料，或通过药物等方法提高方法提高mrna的含量。的含量。mrna的制备的制备:动物细胞或植物细胞动物细胞或植物细胞mrna的制备的制备mrna完整性的检测完整性的检测哺乳动物哺乳动物mrna长度为长度为500-8000bp，大部分，大部分mrna位于位于1.5-2.0kb之间。之间。 mrna的提取的提取 全长

34、全长mrna具有一个具有一个polya的的3末端，可以被用于末端，可以被用于mrna的分离。的分离。 可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mrna。2、第一链、第一链cdna的合成的合成oligo(dt)引导的引导的dna合成法：合成法：利用真核利用真核mrna分子所具有的分子所具有的poly(a)尾巴的特性，尾巴的特性，加入加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dt)短片段，由反转录酶合成短片段，由反转录酶合成cdna第一链第一链 缺点：因为逆转录酶无法到达缺点：因为逆转录酶无法到达mrna分子的分子的5末末端，必须从端，必须从

35、3末端开始合成末端开始合成cdna。对于大分子量。对于大分子量的较长的的较长的mrna分子无法达到分子无法达到5末端。末端。cdna第一链的合成第一链的合成 随机引物引导的随机引物引导的cdna合成法合成法 ： 根据许多可能的序列，合成出根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cdna的引物。在应用这种混合引物的情况下，的引物。在应用这种混合引物的情况下，cdna的合成可以从的合成可以从mrna模板的许多位点同时模板的许多位点同时发生，而不仅仅从发生，而不仅仅从3末端的末端的oligo(dt)引物

36、一处开引物一处开始。比较容易合成特长的始。比较容易合成特长的mrna分子的分子的5端序列端序列 随机引物随机引物 cdna 合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建cdna 文文库，一般用于克隆特定库，一般用于克隆特定 mrna的的 5 末端，如末端，如 rt-pcr 和和 5-race 。3 3、第二链、第二链cdnacdna的合成的合成cdnacdna第二链的合成就是将上一步形成的第二链的合成就是将上一步形成的mrna-cdnamrna-cdna杂合双链变成互补双链杂合双链变成互补双链cdnacdna的过程。的过程。cdnacdna第二链的合成的方法大致第二链的合成的方法大致4 4种：种：

37、自身引导合成法、置换合成法、引导合自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物衔接头合成法。成法、引物衔接头合成法。自身引导合成法：自身引导合成法：获得的单链获得的单链cdna3cdna3端会形成发夹结构，以此端会形成发夹结构，以此作为第二链合成的引物，在作为第二链合成的引物，在klenowklenow酶或反转录酶或反转录酶的作用下，合成酶的作用下，合成cdnacdna的第二链。的第二链。缺点：缺点： s1s1核酸酶切割核酸酶切割cdnacdna的发夹状结构时，的发夹状结构时，会导致对应于会导致对应于mrna 5mrna 5端的地方的序列出现缺端的地方的序列出现缺失和重排。失和重排。 s1s1

38、核酸酶的纯度不够时，会偶尔核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链破坏合成的双链cdnacdna分子。分子。自身合成法：获得的双链自身合成法：获得的双链cdna5端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。置换合成法：置换合成法： cdna 第一链合成反应的产物第一链合成反应的产物 cdnamrna不经不经变性直接与变性直接与 rna酶酶 h 和大肠杆菌和大肠杆菌 dna 聚合酶聚合酶混合，此时混合，此时 rna 酶酶 h 在杂合双链的在杂合双链的 mrna 链上链上产生缺口（内切作用）并形成部分产生缺口（内切作用）并形成部分 cdna 单链区单链区（外切作用）（外切作用）dna 聚合酶聚合酶则以

39、残存的则以残存的 mrna作为引物合成作为引物合成 cdna 第二链，最后用第二链，最后用 t4dna连连接酶修复缺口。用这种方法获得的接酶修复缺口。用这种方法获得的 cdna双链分双链分子含有残留的一小段子含有残留的一小段 rna，但这并不影响后续的，但这并不影响后续的克隆操作。克隆操作。 优点：优点：cdna双链合成效率高，操作简捷无需对双链合成效率高，操作简捷无需对第一链合成产物进行额外的变性处理，更重要的第一链合成产物进行额外的变性处理，更重要的是避免了是避免了 cdna 双链分子末端的缺损。双链分子末端的缺损。置换合成法置换合成法引物合成法：引物合成法：在第一链合成完毕后，变性残在第

40、一链合成完毕后，变性残留的留的 mrna，用末端脱氧核苷酰转移酶在，用末端脱氧核苷酰转移酶在 cdna 游离的游离的 3羟基上添加同聚物（羟基上添加同聚物（dc）末）末端，然后将之与人工合成的端，然后将之与人工合成的 oligodg退火，退火，形成引物结构，在形成引物结构，在 klenow 酶的作用下合成酶的作用下合成第二条第二条 cdna 链。链。引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cdna 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列引物引物- -衔接头法衔接头法4、双链、双链cdna的分级分离的分级分离mrna通过反转录形成通过反转录形成cdna，在插入到克隆，在插入到克隆载体前，通过

41、琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cdna分子分离开来。分子分离开来。优点：优点：避免了分离过程中避免了分离过程中mrna被污染的被污染的rna酶降解酶降解增加了获得全长增加了获得全长cdna克隆的概率。克隆的概率。获得更准确的分级分离效果（分子量）。获得更准确的分级分离效果（分子量）。5、双链、双链cdna克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖主中繁殖cdna末端的处理末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链了避免用平末端与载体连接，对双链cdna

42、的末的末端进行加工是十分必要的。端进行加工是十分必要的。方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端。的黏性末端。末端转移酶末端转移酶可以向可以向cdna末端加上与克隆载体末端加上与克隆载体末端互补的尾部。末端互补的尾部。6、利用、利用pcr技术构建技术构建cdna文库文库能够从极其有限的起始材料中构建能够从极其有限的起始材料中构建cdna文库。文库。以总以总rna为模板合成为模板合成cdna，无需，无需mrna的纯化的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。丢失。能够提高能够提高cdna文库的完整性，获得那些低水平文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的表达的基因的cdna克隆。此法对植物基因功能克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究