基因结构与表达分析的基本策略

1、1基因结构与表达分析的基本策略基因结构与表达分析的基本策略strategy for structure and expression analyses of genes分子生物学系分子生物学系2 2分子生物学的三大核心技术分子生物学的三大核心技术dnadna序列分析序列分析dnadna测序，测序，19771977聚合酶链式反应聚合酶链式反应dnadna扩增，扩增，19851985dnadna重组技术重组技术基因克隆，基因克隆，197319733一、dna序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反应三、聚合酶链式反应四、基因芯片和微阵列四、基因芯片和微阵列五、五、 westernwestern免疫

2、印迹免疫印迹主要内容4（一）（一）双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 (sanger ,1977)一、一、dna序列分析序列分析（二）（二）dna自动化序列分析自动化序列分析（三）化学降解法（三）化学降解法(gilbert ,1977)5frederick sanger1918 walter gilbert1932 the nobel prize in chemistry 1980paul berg19266dna测序技术基础：测序技术基础：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, page）技术，可分离

3、差别仅）技术，可分离差别仅1个碱基的个碱基的单链寡核苷酸单链寡核苷酸dna片段。片段。 7( (一）双脱氧末端终止法一）双脱氧末端终止法（dideoxy chain termination） 8atp、datp和和ddatp的结构的结构atpaohohhhdatpddatpntp: 核苷三磷酸核苷三磷酸atp、gtp、 ctp、 utp的合称；的合称；dntp: 脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸datp、dgtp 、dctp、dttp；ddntp: ddatp、ddgtp、ddctp 、ddttp；9掺入掺入n个核苷酸个核苷酸dna合成反应模式图合成反应模式图10dnadna单链模板单链模板引物引

4、物 掺入掺入ddntpddntp延伸的新合成链延伸的新合成链 末端终止末端终止111. 双脱氧末端终止法原理双脱氧末端终止法原理 dnadna合成反应中，合成反应中，ddntpddntp不存在不存在3-oh3-oh末端末端，故不能与下一个核苷酸，故不能与下一个核苷酸的的5-5-磷酸基团磷酸基团形成形成33，5-5-磷酸二磷酸二酯键，导致酯键，导致dnadna新链的延伸提前终止于新链的延伸提前终止于ddntpddntp 。12ddctpddatpddttpddgtpdctpdatpdttpdgtpa g c t5 t4711g a a t g a 3acg ct132. dna2. dna测序主

5、要步骤测序主要步骤14a a反应管反应管g g反应管反应管g g反应管反应管t t反应管反应管c c反应管反应管t t反应管反应管1516 g a t c17 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链单链dnadna模板的制备模板的制备 dna dna模板与测序引物退火模板与测序引物退火 掺入法标记反应掺入法标记反应 延伸延伸- -终止反应终止反应 放射自显影放射自显影 阅读测序结果阅读测序结果测序步骤测序步骤 18（二）（二）dna测序自动化原理测序自动化原理 采用采用4种不同的荧光分别标记种不同的荧光分别标记4种种ddntp终止反应产物，替代放射终止反应产物，替代放射性同位素标记

6、是实现性同位素标记是实现dna测序自动测序自动化的基础。化的基础。19ddctpddatpddttpddgtpdctpdatpdttpdgtp5 tg a a t g a 3acg ct2021表示一个表示一个snp位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为别为c和和t,因此该位点为因此该位点为ct杂合型，如果该位点只有一杂合型，如果该位点只有一个峰个峰c或者或者t，则该位点基因型为，则该位点基因型为cc或或tt纯合型纯合型22dna自动测序步骤自动测序步骤 4种不同荧光染料标记终止物种不同荧光染料标记终止物ddntpssanger测序反应测序反应反应产物

7、反应产物同一同一泳道电泳分离泳道电泳分离 激光激发不同大小激光激发不同大小dna片段上的荧光片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光 荧光信号采集、计算机分析与荧光信号采集、计算机分析与dna自动排序自动排序23dye labeled dideoxyterminators on abi 3730 capillaries 24 与末端终止法不同，与末端终止法不同，化学化学降解法是建立在对原有降解法是建立在对原有dnadna的的化学降解过程基础上。化学降解过程基础上。 （三）化学降解法（三）化学降解法25 将待测将待测dnadna片段片段33或或55端进行同位素端进

8、行同位素标记，标记的标记，标记的dnadna片段分成五个反应，分别片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使切割，使dnadna片段分别于某一种（类）碱基片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离处断裂。电泳分离5 5组组dnadna混合物，放射自混合物，放射自显影检测末端标记的显影检测末端标记的dnadna链的电泳区带位置。链的电泳区带位置。化学降解法化学降解法原理原理26 化学降解化学降解g g反应模式图反应模式图 硫酸二甲酯硫酸二甲酯哌啶哌啶metmetmetmet27最新测序技术最新测序技术 454技术技术(roche ) 焦

9、磷酸测序（焦磷酸测序（pyrosequencing） solexa测序技术测序技术(illumina ) solid技术技术(abi ) 连接法测序连接法测序28举例：举例：solexa测序测序hiseq 200029 solexa 测序：在一个反应中同时加入测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序种核苷的标签，采用边合成边测序（ sbs sequencing by synthesis ）。）。 完成人类基因组草图不同测序仪的比较图完成人类基因组草图不同测序仪的比较图30二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridization ）（一）（一）southern

10、印迹杂交：检测印迹杂交：检测dna (southern blot hybridization) southern em , 1975（二）（二）northern印迹杂交：检测印迹杂交：检测rna (northern blot hybridization) stark gr，197731核酸分子杂交原理核酸分子杂交原理 标记的标记的单链核酸探针单链核酸探针与待检测的与待检测的靶单链靶单链dna或或rna局部互补结合形成局部互补结合形成杂交双链。杂交双链。 应用：应用：核酸靶核酸靶dna或或rna序列的序列的定性与定量分析。定性与定量分析。323333印迹技术印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的

11、生物利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到大分子转移到ncnc等各种膜上，使之成为固等各种膜上，使之成为固相化分子。相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为的墨迹，因此称之为“blottingblotting”, , 译为译为印迹技术。印迹技术。3434探针技术探针技术 用放射性核素、生物素或荧光染料标用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为链被称为“探针探针”。 探针可以与固定在探针可以与固定在ncnc膜上的核苷酸结膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在

12、。合，判断是否有同源的核酸分子存在。 35southern印迹杂交原理印迹杂交原理 将电泳分离的将电泳分离的待测待测dna片段结合到片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 （一）（一）southern印迹杂交印迹杂交应用：应用：dnadna（基因组（基因组dnadna）分子的定性或定）分子的定性或定 量分析。量分析。361. 制备基因组制备基因组dna2. 用限制性内切核酸酶消化基因组用限制性内切核酸酶消化基因组dna 3. 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离dna酶切片段酶切片段4.

13、 凝胶预处理凝胶预处理（如强碱，（如强碱，dna双链变为单链）双链变为单链） 5. southern 印迹转移印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与标记核酸探针、探针与dna片段杂交片段杂交7. 杂交结果显示杂交结果显示 southern印迹杂交基本过程印迹杂交基本过程37southern印迹杂交示意图印迹杂交示意图38 将电泳分离的将电泳分离的待测待测dna片段结合到片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 3940 地中海贫血的地中海贫血的southern blot 基因诊断基因诊断（1

14、）仅一条染色体上的一个）仅一条染色体上的一个基因缺失或缺陷，则基因缺失或缺陷，则链的合成部分受抑制，称链的合成部分受抑制，称为为+地贫；地贫；（2）每条染色体上的）每条染色体上的2个个基因均缺失或缺陷，称为基因均缺失或缺陷，称为0地贫；地贫； (3) 1、2序列基本一致；序列基本一致； 基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同程度的缺失可引起不同类型的 地中海贫血。地中海贫血。12+ + +0 + 0 0 041bamhibamhi 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe 地中海贫血的直接基因诊断地中海贫血的直接基因诊断42 / /- /- - - /- - - - / -

15、- 正常正常 缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb43（二）（二）northern印迹杂交印迹杂交 (northern blot hybridization) 指将指将rna变性及电泳分离后，并转变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定其中特定mrna分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。 用于用于mrna进行定性和定量分析。进行定性和定量分析。 44rna琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbnt36382604623northern blot hybridization28s18s应用举例应用举例45gapdh0

16、d 2d 4d 6d 8dnorthern blot 杂交分析杂交分析mrna的表达的表达靶靶 mrna3-磷酸甘油醛脱氢酶 4646三、其他杂交技术三、其他杂交技术1. 斑点杂交斑点杂交 (dot blot hybridization） 将将rna或或dna变性后变性后直接点样于硝酸纤维素膜直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定中特定基因及其表达的定性及定量研究。性及定量研究。47472.原位杂交原位杂交（in situ hybridization） 用标记的核酸探用标记的核酸探针与组织切片或细胞针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序中的待测核

17、酸互补序列杂交，可对核酸进列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对行定性、定位和相对定量分析。定量分析。 48 3 3核酸酶核酸酶s1 s1 保护分析法保护分析法 (nuclease s1 protection assay(nuclease s1 protection assay） 单链单链dnadna探针探针与待测与待测rnarna形成形成dna/rnadna/rna杂交双链，加入核酸酶杂交双链，加入核酸酶s1s1专专一性地降解未形成杂交体的一性地降解未形成杂交体的dnadna或或rnarna单链，单链，dna/rnadna/rna杂交双链则受到杂交双链则受到保护而不被降解。保护而不被降解。 4

18、94rna酶保护分析法酶保护分析法 （rnase protection assay，rpa）50rpa基本程序：基本程序：待测待测rnarna的分离的分离体外转录标记体外转录标记rnarna探针探针待测待测rnarna与探针与探针rnarna进行液相杂交进行液相杂交 rna酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离51三、聚合酶链式反应三、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, pcr)（一）（一）pcrpcr技术原理技术原理（二）耐热（二）耐热dnadna聚合酶聚合酶（三）（三）pcrpcr引物及设计原则引物及设计原则（四）（四）pcr

19、pcr条件的优化条件的优化 （五）（五）pcrpcr改进技术改进技术（六）其它（六）其它pcr技术技术52聚合酶链式反应聚合酶链式反应(pcr) :（一）（一）pcrpcr技术原理技术原理 mullis k. 1985年年发明的一种模拟天然发明的一种模拟天然dna复制过程的核酸复制过程的核酸体外扩增技术。体外扩增技术。 the nobel prize in chemistry 1993 53the replication of dna54 原理：原理：pcrpcr是模拟天然是模拟天然dnadna复制过复制过程，利用程，利用dna dna 聚合酶催化一对引物聚合酶催化一对引物间特异间特异dnad

20、na片段合成的体外扩增技片段合成的体外扩增技术。术。 其主要热循环过程为：变性、其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。退火、延伸三个步骤。551. pcr循环由三步组成：循环由三步组成： 变性变性（denaturation）退火退火（annealing）延伸延伸（extension）高温高温合适温度合适温度合适温度合适温度5657582. pcr扩增终产物大小扩增终产物大小: 介于两条退火引物介于两条退火引物55末端之间末端之间的的双链双链dna片段片段。循环一循环一59循环二循环二60循环三循环三61一对引物：正向和反向一对引物：正向和反向限制了限制了pcr扩增的片段的范围扩增的片段

21、的范围5/5/3/3/5/5/3/3/62 5cagttaagggggcaggagtggcgctgctcacctctggtgccaaagggcggcgcagcggctgccgagctcggccctggaggcggc agaacatggtgcgcaggttcttggtgaccctccggattcggcgcgcgtgcggcccgccgcgagtgagggttttcgtggttcacatcccgcggctcacgggggagtgggcagcgccaggggcgcccgccgctgtggccctcgtgctgatgctactgaggagccagcgtctagggcagcagccgcttcctagaa

22、gaccaggtcatgatgatgggcagcgcccg agtggcggagctgctgctgctccacggcgcg 3ggtccagtactactacccgtagaacatggtgcgcaggtt 3. 引物设计实例引物设计实例63 y=a（1+e）n y: 扩增产物的量扩增产物的量 a: 最初靶最初靶dna分子数分子数 e: pcr扩增效率扩增效率 n: 循环次数循环次数 3. pcr产量产量 当当e100, a=1时时 y=2n 2n(引物延伸产物的量）引物延伸产物的量）64（二）平台期与平台效应（二）平台期与平台效应1. 平台效应平台效应（plateau effect）：）： p

23、cr经过一定数量的循环后，经过一定数量的循环后，dna片段不再呈指数累积，而是进入线性增片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，长期或静止期，即平台效应即平台效应。影响因素：影响因素： 引物及引物及dntp底物浓度降低。底物浓度降低。 酶与模板比例下降。酶与模板比例下降。65pcr平台效应平台效应66（二）耐热（二）耐热dnadna聚合酶聚合酶1. taq dna聚合酶（聚合酶（实现了实现了pcr自动化）自动化） 从嗜热水生菌从嗜热水生菌thermus aquatics yt-1株中株中直接分离出来。直接分离出来。 95的半衰期的半衰期: 40 min 最适温度最适温度: 72 80

24、催化反应催化反应速率速率: 150300核苷酸核苷酸 / 秒秒/ 酶分子酶分子6768taq dna聚合酶特性：聚合酶特性： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 53外切酶活性；外切酶活性； 较弱的非模板依赖性；较弱的非模板依赖性； 缺乏缺乏35外切酶活性。外切酶活性。69pcr thermal cycler70pcrpcr产物的产物的琼琼脂糖凝胶电泳分析脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpmarkerpcr产物产物71无机离子及抑制剂的影响无机离子及抑制剂的影响 taq dna聚合酶的活性聚合酶的活性对对mg 2+ 浓浓度和单

25、价离子（度和单价离子（k+或或nh4+）的性质和）的性质和浓度较敏感。浓度较敏感。 最适最适mg 2+浓度浓度：2 mmol/l k+浓度浓度：50 mmol/l72u 几种高保真的耐热几种高保真的耐热dna聚合酶聚合酶 1. tth dna聚合酶聚合酶 2. vent dna聚合酶聚合酶 3. pfu dna聚合酶聚合酶73（三）（三）pcrpcr引物设计原则引物设计原则引物的化学本质是什么？引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸单链寡核苷酸dna或或rna片段。片段。dna复制引物：单链复制引物：单链rna片段片段pcr引物：引物： 单链单链dna片段片段74pcr引物设计原则引物设计原则：1

26、.1.引物与模板的序列要完全互补引物与模板的序列要完全互补2.2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构或发夹结构3.3.引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发dnadna聚合反应聚合反应( (错配错配) )755cactgaacgtaggcct3 3gcaggttcagtgacttgcatccggatgcaac5特异扩增特异扩增5cactgaacgtaggcct33ggatctacatgcgacttaatccggagatacc5错误引发错误引发1. 引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补2. 2. 引物不能在模板的非

27、目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发 dnadna聚合反应聚合反应( (错配错配) )76引物之间应避免引物之间应避免33端互补端互补3.3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构或发夹结构77引物自身不应形成发夹结构引物自身不应形成发夹结构784.4.其它原则其它原则: :引物引物33末端碱基末端碱基：最好选：最好选t t、c c、g g，不选，不选a a 避免出现避免出现3 3个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如gggggg或或cccccc 引物引物55末端碱基可不与模板末端碱基可不与模板dnadna互补互补7980模板模板引物引物taq

28、dna聚合酶聚合酶dntpmg2+退火退火变性变性延伸延伸pcr反应反应81（四）（四）pcrpcr条件的优化条件的优化1. taq dna聚合酶浓度：聚合酶浓度： 1.02.5 u/100 l反应液反应液 2. dntp浓度：浓度：20200 mol/l 3. mg2+浓度：浓度：0.52.5 mmol/l 4. 引物浓度：引物浓度：0.10.5 mol/l82（五）（五）pcr改进技术改进技术1. rt-pcr (reverse transcription pcr) 以以mrnamrna为模板逆转录合成为模板逆转录合成cdnacdna，再以此再以此cdnacdna为模板进行为模板进行pcr

29、pcr反应反应。83rt-pcr原理原理84逆转录酶逆转录酶 amv（avian myeloblastosis virus） 酶活性最适温度酶活性最适温度42 mmlv（moloney murine leukemia virus）：最适温度）：最适温度37 852. 定量定量rt-pcr（qrt-pcr）半定量半定量rt-pcr 以样本以样本mrna为模板逆转录为模板逆转录合成合成cdna，在不同引物对引导，在不同引物对引导下共同下共同pcr扩增扩增“看家看家”基因基因和和目的基因目的基因cdna 。86 选择内对照基因选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比组织中普遍表达、表达量比较恒定的较

30、恒定的“看家看家”基因基因mrna。如如gapdh和和 -actin mrna等。等。 半定量标准半定量标准 计算计算pcr 产物产物 ： 靶靶cdna /gapdh cdna87 kpna2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析88893. 实时荧光定量实时荧光定量rt-pcrreal-time fluorescent quantitative pcr，fq-pcr pcr扩增指数期内极小的扩增效扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。率改变会极大地影响产量。 应用：用应用：用于基因于基因dna拷贝数和拷贝数和mrna表达定量分析。表达定量分

31、析。 90荧光染料荧光染料9192 每形成一个每形成一个dnadna双链，双链，就有一定数量的染料结合就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生上去，染料一结合就产生荧光信号，荧光信号，信号强度与信号强度与dnadna分子总数目成正比分子总数目成正比。93 taqman probe 一种水解式荧光标记探针。寡核苷酸一种水解式荧光标记探针。寡核苷酸探 针探 针 的的 5 端 标 记 一 个 荧 光 报 告 基 团端 标 记 一 个 荧 光 报 告 基 团（reporter ），），3端标记一个端标记一个荧光荧光淬灭淬灭基团基团（quencher ）。）。94 每产生一条每产生一条dnadna链

32、，就切断一条探针，链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的信号强度与结合探针的dnadna分子数成正比分子数成正比。95。 分子信标探针（分子信标探针（molecular beacon probe） 该探针具有发夹结构，该探针具有发夹结构，5端标记荧端标记荧光报告基团，光报告基团，3端标记淬灭基团。端标记淬灭基团。96探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。与淬灭染料分离，发出荧光。97实时荧光定量实时荧光定量pcrpcr计算原理计算原理pcr扩增效率的差异使相同的样品扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异最终产量有很大差异9899ct或或tc或或ct值：值： 临界点循环（临界点循环（threshold cycle ），即从基），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数线到指数增长的拐点所对应的循环数100101 传染病诊断、监测与疗效预后评估：传染病诊断、监测与疗效预后评估： 揭示疾病发病机制揭示疾病发病机制102103（六）其它（六）其它pcr技术技术1. 反向反向pcr（inverse pcr）原理）原理 1042. a