第二节其他重要工具酶

1、第二节第二节 其它重要的工具酶其它重要的工具酶dna 聚合酶聚合酶（dna polymerase） dna 聚合酶是催化以聚合酶是催化以 dna 或或 rna 为模板合成为模板合成 dna 的一的一类酶的总称。类酶的总称。 经常使用的经常使用的 dna 聚合酶有大肠杆菌聚合酶有大肠杆菌 dna 聚合酶聚合酶 i(全酶全酶)、klenow 酶、酶、t4 dna 聚合酶、聚合酶、t7 dna 聚合酶、耐高温的聚合酶、耐高温的 taq dna 聚合酶以及反转录酶等。聚合酶以及反转录酶等。 这些这些 dna 聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖核苷酸核苷酸(

2、dntp，包括，包括 datp、 dttp、 dctp 和和 dgtp)连连续的加到双链续的加到双链 dna 引物链的引物链的 3-羟基末端上，催化核苷酸羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的的聚合，形成新的 dna 链。链。dna 聚合酶聚合酶 i dna 聚合酶聚合酶 i 具有三种活性，即具有三种活性，即 5 3 聚合活性、聚合活性、5 3 外外切活性和切活性和 35外切活性。外切活性。 dna 聚合酶聚合酶 i 要发挥作用需满足以下三个条件。要发挥作用需满足以下三个条件。 底物和激活剂：底物和激活剂：dna 聚合酶聚合酶 i 催化聚合反应需要四种催化聚合反应需要四种 dntp(datp、

3、dctp、dttp、dgtp)作为底物，同时作为底物，同时mg2是不可缺少的激活剂。是不可缺少的激活剂。 带有带有 3 -端羟基末端的引物：端羟基末端的引物：dna 聚合酶聚合酶 i 所催化的聚合所催化的聚合反应总是在引物的反应总是在引物的 3 -oh末端基团和搀入的末端基团和搀入的 dntp 之间发生之间发生的，且只能沿引物末端由的，且只能沿引物末端由 5 3 方向延伸。方向延伸。 dna 模板：可以是模板：可以是 ssdna 或或 dsdna，后者只有在其主，后者只有在其主链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。 实验室中，利用实验室中，

4、利用 dna 聚合酶聚合酶 i，通过，通过 dna 缺口平移的方缺口平移的方法制备法制备 dna 探针，可以用于核酸杂交分析。探针，可以用于核酸杂交分析。 双链双链 dna 的单链缺口在的单链缺口在 dna 聚合酶聚合酶 i 的的 5 3 外切作用外切作用下，从缺口的下，从缺口的5端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的缺口的 3端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移缺口平移。 如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则

5、如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的合成产生的 dna 分子即可作为带放射性标记的分子即可作为带放射性标记的 dna分子分子杂交探针。杂交探针。dna 聚合酶聚合酶 idna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段) 是是 e. coli dna 聚合酶聚合酶 i 的蛋白水解产物，特点是：的蛋白水解产物，特点是： 具有具有 dna 聚合酶活性和聚合酶活性和 3 5 核酸外切酶活性，但缺失核酸外切酶活性，但缺失了了 53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解既保留了全酶的高保真性，又不会降解 dna 5 末末

6、端。端。 用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记 dna，同时也可用于同时也可用于 dna 的的缺口补平缺口补平和延伸。和延伸。用途：用途：用随机引物制备探针用随机引物制备探针补平补平5 突出端，形成平末端突出端，形成平末端切除切除3 突出端，形成平末端突出端，形成平末端合成合成cdna第二条链第二条链诱变反应中第二条链的合成诱变反应中第二条链的合成双脱氧法双脱氧法dna序列测定序列测定 (sanger 法法)dna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段)dna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段)t4 dna

7、 聚合酶聚合酶 在模板及引物存在的条件下，在模板及引物存在的条件下，t4 dna 聚合酶聚合酶催化沿催化沿 53 方向合成方向合成 dna。此酶还具有。此酶还具有 35 外切核酸酶的活性，该活性比外切核酸酶的活性，该活性比 dna 聚聚合酶合酶 i 强。与强。与 e. coli dna 聚合酶聚合酶 i 不同，不同，t4 dna 聚合酶不具有聚合酶不具有 53 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。t4 dna 聚合酶聚合酶 缺口填充缺口填充 (无链置换活性无链置换活性) 产生平末端的最佳用酶产生平末端的最佳用酶 补平补平 5 突出端，形成平末端突出端，形成平末端 切除切除 3 突出末端，形成平末端

8、突出末端，形成平末端 通过置换合成法标记探针通过置换合成法标记探针 单链删除后亚克隆单链删除后亚克隆 基因定点突变中第二条链的合成基因定点突变中第二条链的合成 dna片段的末端平滑化示例片段的末端平滑化示例t7 dna 聚合酶 t7 dna 聚合酶是从受聚合酶是从受 t7 噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。 它由两种亚基组成：一种是它由两种亚基组成：一种是 t7 噬菌体基因噬菌体基因 5 编编码的蛋白质，其分子量为码的蛋白质，其分子量为84 kd；另一种是大肠；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白杆菌编码的硫

9、氧还蛋白(thioredoxin)，其分子量，其分子量为为 12 kd。 t7 dna聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的 dna 聚合聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。酶，能连续合成数千个核苷酸。 除聚合活性以外，除聚合活性以外，t7 dna 聚合酶还具有单链和双链的聚合酶还具有单链和双链的 35外切酶活性，它的活性也很强，约为外切酶活性，它的活性也很强，约为 klenow 酶的酶的 1000 倍。倍。 t7 dna 聚合酶不具有聚合酶不具有 53外切酶活性。由于外切酶活性。由于 t7 dna 聚聚合酶的高度续进性和不受合酶的高度续进性和不受 dna 二级结

10、构的影响，在分子生二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板物学中常被用于长模板 dna 的引物延伸反应。同时，经修的引物延伸反应。同时，经修饰的饰的 t7 dna 聚合酶还是双脱氧终止法对长片段聚合酶还是双脱氧终止法对长片段 dna 进行进行测序的理想工具酶。测序的理想工具酶。t7 dna 聚合酶聚合酶 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 碱性磷酸酶是一类能特异性地切去碱性磷酸酶是一类能特异性地切去dna或或rna的的5-磷酸基团的工具酶，磷酸基团的工具酶，它们的作用底物可以是它们的作用底物可以是ssdna或或dsdna或或rna，也可以是，也可以是ntp或

11、或dntp。用途用途 1）去除）去除dna片段的片段的5-末端的磷酸基。防止线状末端的磷酸基。防止线状dna的自身环化的自身环化（self-ligation）。）。 2）除去）除去pcr反应后残存的反应后残存的dntp。pcr产物进行测序时，在反应体产物进行测序时，在反应体系中如果有多余的系中如果有多余的primer和和dntp，将影响测序反应的正常进行。，将影响测序反应的正常进行。使用使用exonuclease i分解残存的分解残存的primer；用；用sap处理可降解多余的处理可降解多余的dntp，之后不需要对，之后不需要对pcr产物进行精制，立即可以进行测序反应。产物进行精制，立即可以进

12、行测序反应。 从细菌中分离的碱性磷酸酶从细菌中分离的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, e.coli c75; bap) 从小牛肠中分离的碱性磷酸酶从小牛肠中分离的碱性磷酸酶 (alkaline phosphase, calf intestinal, cap)。 从虾提取的虾碱性磷酸酶从虾提取的虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，sap ） 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶t4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 （t4 polynucleotide kinase，pnk） dna 或或 rna 5 末端的磷酸化，以便进行末端的磷酸化，

13、以便进行连接反应。连接反应。 dna 或或 rna 的末端标记，用作探针和进的末端标记，用作探针和进行行 dna 测序。测序。 双链双链dna片段的磷酸化片段的磷酸化在微量离心管中配置溶液如下：在微量离心管中配置溶液如下：3737反应反应3min,703min,70反应反应5 51010分钟分钟使酶失活。进一步用酒精沉淀的方法精制使酶失活。进一步用酒精沉淀的方法精制dnadna。t4 polynucleotide kinase 2 latp(10mm) 5 l10 reaction buffer 5 l双链双链dna片段片段 10 pmol 超纯水超纯水 补足补足 50 ldna 酶酶 i （

14、dnase） dna 酶酶 i（dnase i）是随机水解双链或单链）是随机水解双链或单链 dna的一种内切酶，使的一种内切酶，使 dna 分子降解成带有分子降解成带有 5磷酸末磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物。端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物。 进行重组进行重组 dna 研究时，必须注意防止研究时，必须注意防止 dna 酶的污酶的污染，否则制备的染，否则制备的 dna 样品将会降解。样品将会降解。 因此使用的器皿或试剂要高温处理，样品中需加因此使用的器皿或试剂要高温处理，样品中需加 edta，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。 用用 途途 1）与）与dna po

15、lymerase i 一起用于切口平移一起用于切口平移（nick translation）。）。 2）在）在mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（存在的条件下，为鸟枪法测序（shot gun sequencing）制作）制作dna文库。文库。 3）用于足迹法（）用于足迹法（foot printing）分析）分析dna-蛋白蛋白质相互作用。质相互作用。 4) dnase i 可以作用于单链可以作用于单链 dna、双链、双链 dna、染色质和染色质和rna:dna杂交链。杂交链。 rna酶a（ribonuclease a） ribonuclease a是一种内切核糖核酸酶，是一种内切核糖核酸酶，可在

16、可在c和和u残基位置特异性降解单链残基位置特异性降解单链rna。该酶可以切割核苷上该酶可以切割核苷上5-核糖与邻近嘧啶核核糖与邻近嘧啶核苷苷3-核糖上磷酸基团之间的磷酸二脂键。核糖上磷酸基团之间的磷酸二脂键。产生的产生的2，3-环磷酸可以水解成相应的环磷酸可以水解成相应的3-核苷磷酸盐。核苷磷酸盐。 产品用途：产品用途：质粒和基因组质粒和基因组dna制备时用于去除制备时用于去除rna； 重组蛋白质制备过程中，除去溶液中的重组蛋白质制备过程中，除去溶液中的rna。 质粒提取后用rna酶处理其它的其它的rna酶酶 rna 酶酶t1只作用于鸟嘌呤核苷酸的只作用于鸟嘌呤核苷酸的3磷酸根，磷酸根，切开与

17、其相邻核苷酸连接的切开与其相邻核苷酸连接的 5磷酸键；磷酸键； rnase h 可以降解可以降解 dna-rna杂交链中的杂交链中的 rna分子。分子。防护防护rna酶的污染酶的污染 人体的分泌物如唾液、汗液中都含有人体的分泌物如唾液、汗液中都含有 rna 酶。酶。 因此在操作因此在操作 rna 样品时，必须戴手套，实样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经验用的玻璃器皿都要经 250 烘烤烘烤 4h(rna 酶耐热酶耐热)，或用，或用 rna 酶的抑制剂酶的抑制剂处理。处理。末端转移酶的主要用途末端转移酶的主要用途 末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转移酶，分子量为末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转

18、移酶，分子量为 60 kd，来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴样细胞。在二价阳离来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴样细胞。在二价阳离子的存在下，该酶能够逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性子的存在下，该酶能够逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性 dna 分子的分子的3-oh末端。末端转移酶在反应过程中不需要模末端。末端转移酶在反应过程中不需要模板的存在。板的存在。 对不同的对不同的dntp所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，则是嘧啶核苷酸，则co2+为首选阳离子；如果加入的核苷酸是为首选阳离子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，则嘌呤核苷酸，则mg2+为首

19、选阳离子。为首选阳离子。 当反应体系中只有一种当反应体系中只有一种dntp时，就可以在时，就可以在dna分子的分子的3末末端加上同聚物尾巴端加上同聚物尾巴(homopolymeric tail)。末端转移酶的主要用途末端转移酶的主要用途 分别给外源分别给外源 dna 片段和载体分子加上互补的同聚片段和载体分子加上互补的同聚物尾巴，以使它们可以连接起来。物尾巴，以使它们可以连接起来。 例如：可以给用做克隆载体的线性例如：可以给用做克隆载体的线性 dna 分子的分子的 3-oh 末端加上末端加上poly(dt)尾巴，给待克隆的外源尾巴，给待克隆的外源 dna 片段的片段的 3-oh 末端加上末端加

20、上poly(da)尾巴。然后将外源尾巴。然后将外源 dna 连接于载体中，形成重组连接于载体中，形成重组 dna 分子。分子。末端转移酶的主要用途末端转移酶的主要用途 d n a 连接酶 作用机制及特点dna 连接酶(dna ligase)能利用 nad+或 atp 中的能量，催化多段 dna 的 3羟基和5磷酸末端之间形成 3，5-磷酸二酯键，把两个 dna 片段连接在一起，封闭 dna 双链上形成的切口(见图 3-3)。连接酶和限制酶一样是基因工程中不可缺少的重要工具。 应当注意，dna 连接酶只能连接双链 dna 分子的单链切口(nick)，既不能催化两条单链 dna 分子的连接(t4

21、dna 连接酶例外)，也不能催化双链中一个或多个核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。dna 连接酶的分类 常用的 dna 连接酶有 t4 dna 连接酶和大肠杆菌 dna 连接酶两种。 在这两种连接酶中，最常使用的是 t4 dna 连接酶，它的连接效率高，既可用于黏性末端的连接，也可用于平齐末端的连接。一般来说，片段越小，末端黏性越强，连接反应则可使用较高的温度。dna 平齐末端的连接比黏性末端连接效率低得多。平齐末端的连接一般需要在 1020 进行，且需要较高的 dna 浓度和 t4 dna 连接酶的浓度。而黏性末端的连接一般在 1626 进行。 大肠杆菌大肠杆菌 dna 连接酶催化的连接反应

22、中所需要的能量由连接酶催化的连接反应中所需要的能量由 nad+提供，提供， t4 dna连接酶催化的反应中所需要的能量由连接酶催化的反应中所需要的能量由 atp 提供。提供。其他方面大肠杆菌其他方面大肠杆菌 dna 连接酶和连接酶和 t4 dna 连接酶的作用连接酶的作用机制相同。机制相同。 各种连接酶特性的比较各种连接酶特性的比较 反转录酶反转录酶 商品化的反转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞商品化的反转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞瘤病毒瘤病毒(amv)，另一种来自大肠杆菌中表达的，另一种来自大肠杆菌中表达的 moloney 鼠白血病病毒鼠白血病病毒(mo-mlv)。 它们均具有：它们均具有： 依赖于依赖于 rna 的的 dna 聚合酶活性；聚合酶活性； rnase h 活性活性(即持续地、特异地降解即持续地、特异地降解 dna-rna 杂交链中的杂交链中的 rna 链的活性链的活性)； 依赖于依赖于 dna 的的 dna 聚合酶活性。聚合酶活性。 amv 及及 mo-mlv 反转录酶在许多