植物生理学实验：实验四叶绿素的提取、理化性质和含量测定

1、实验四 叶绿素的提取、理化性质和含量测定1. 实验目的n提取叶绿素n叶绿素的物理性质n叶绿素的化学性质n叶绿素含量的测定2. 实验原理 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质 吸收光谱 荧光现象 2.3 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿体色素n叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”n亲水的“头部”：镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合n亲脂的“尾巴”：叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性2.2 叶绿素的

2、物理性质1) 吸收光谱2) 荧光现象3) 含量测定1) 叶绿素的吸收光谱2) 荧光现象叶绿素溶液的透射光呈绿色，其反射光呈红色的现象。3) 含量测定n叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和645 nm；n叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（均为34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。n故叶绿素浓度 COD652 / 34.5 ( mg/mL)n叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重 Chl: 强吸收区: 640-700nm(红) & 400-500nm(蓝紫); 不吸收区: 500-600nm (呈绿） Carotene: 强吸

3、收区: 400-500 (蓝紫); 不吸收区：500以上（呈黄色或棕色）不用蓝光区，用652 nm2.3 叶绿素的化学性质1) 叶绿素的结构2) 取代反应3) 皂化反应1) 叶绿素的结构n叶绿素a与b很相似，n不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。 2) 取代反应 稀酸 去镁 铜代 浓酸 去镁 水解卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 n稀酸 叶绿素溶液与稀酸作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为铜代叶绿素等，深绿色；n浓

4、酸 叶绿素溶液与浓酸作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。叶绿素去镁叶绿素铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）3) 皂化反应n叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。n叶绿素与碱皂化的盐能溶于水，可将叶绿素和类胡萝卜素分开。n叶绿素的盐形成以后，易溶于稀乙醇溶液中，不能进入苯层n类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中n一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液n低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层 3 材料、试剂与配备（

5、1）材料：菠菜叶片（2）仪器设备： 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶，分光光度计，水浴锅等（3）试剂：95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂4.1 叶绿素的提取1. 新鲜菠菜叶片，剪碎成小块（去掉中脉）混匀；2. 称取剪碎的样品3.0 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 mL的95%乙醇，研磨匀浆（豆浆状），再加乙醇混匀；3. 过滤至25 mL容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25mL，摇匀。4 实验步骤4.2 叶绿素的荧光 取3 mL叶绿素提取原液，观察其透射光、反射

6、光的颜色；4.3 叶绿素含量的测定 取5mL叶绿素溶液移入50 mL容量瓶，用乙醇定容。 1) 叶绿素吸收光谱 以95%乙醇作为空白对照，在400-700 nm之间，每隔20 nm读OD值，然后以波长为横坐标，以OD为纵坐标作图 2) 叶绿素含量测定 以95%乙醇作为空白对照，测OD6524.4 叶绿素的化学性质 1) 取代反应 稀酸n取5 mL叶绿素原液，一滴滴加入醋酸，观察颜色变化；n向上述加醋酸的叶绿素溶液中加少量CuAc颗粒，65水浴加热，观察其颜色变化。 浓酸n取5 mL叶绿素原液，加入一滴浓盐酸，观察颜色变化。 2) 皂化反应 取3 mL叶绿素原液，加1 mL 20% NaOH-甲

7、醇溶液，摇匀， 65水浴5 min； 取出冷却后，先加3 mL苯，再加3 mL水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。处 理 颜色变化/分层 原 理荧光现象醋酸CuAc浓HCl皂化反应5 结果记录与数据处理5.1 实验现象记录叶绿素的理化性质5.2 绘制叶绿素吸收光谱曲线5.3 叶绿素含量计算公式叶绿素的含量（mg / g）= 叶绿素的浓度体积稀释倍数/样品鲜重6 注意事项操作应在弱光下进行 ？研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜分光光度计的正确使用(更换波长后要调0)皂化反应最后做 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30

8、-40的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。 7 思考题提取时为何要加入MgCO3？为何选用652 nm 测叶绿素的含量？解释皂化反应的分层现象。 4.2 叶绿素的荧光 取3 mL叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光的颜色； 4.3.1 叶绿素吸收光谱 以95%乙醇作为空白对照，在400-700 nm之间，每隔20 nm读OD值，然后以波长为横坐标，以OD为纵坐标作图 4.3.2 叶绿素含量测定:以95%乙醇为空白，测OD652 4.4.1 取代反应 4.4.1.1 稀酸：n取5 mL叶绿素原液，一滴滴加入醋酸，观察颜色变化；n向上述加醋酸的叶绿素溶液中加少量CuAc颗粒，65水浴加热10 min，观察其颜色变化。 4.4.1.2 浓酸n取5 mL叶