第二章生物化学

1、 第二章第二章 沉沉 淀淀 法法 基本原理基本原理制备蛋白质制备蛋白质制备核酸制备核酸n根据不同物质在溶剂中的根据不同物质在溶剂中的溶解度溶解度不同不同而达到分离的目的，通过沉淀，将目而达到分离的目的，通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。相，而与杂质得到初步的分离。第一节第一节 基本原理基本原理 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）: :多用于多用于蛋白质和酶蛋白质和酶 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀：多用于核酸，也用于蛋白质多用于核酸，也用于蛋白质 选择性沉淀选择性沉淀：热变性及酸碱变性沉淀法热变性及酸碱变性沉淀法 非离子多

2、聚物沉淀法非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇，用于生物大分子聚乙二醇，用于生物大分子 常用的几种沉淀方法：常用的几种沉淀方法：第二节第二节 制备蛋白质制备蛋白质 盐析法盐析法 有机溶剂法有机溶剂法 选择性沉淀法选择性沉淀法 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 沉淀法沉淀法 一、盐析法一、盐析法n 概念：概念：在溶液中加入在溶液中加入大量的大量的中性盐使生物大分子中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为沉淀析出的过程称为“盐析盐析”。 n基本原理：基本原理：中性盐夺走水分子，破坏了水膜，暴露中性盐夺走水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体；出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶

3、体；n分级沉淀：分级沉淀：调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：蛋白质分别沉淀。如：制备蛋白质制备蛋白质血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (nhnh4 4) )2 2soso4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出1、基本原理、基本原理2 2、盐析盐析突出的优点突出的优点 成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析法盐析法3.影响盐析的因素影响盐析的因素n蛋白浓度：高浓度的蛋白质，可以节约蛋白浓度：高浓度的

4、蛋白质，可以节约盐的用量，但蛋白质浓度过高，会发生盐的用量，但蛋白质浓度过高，会发生严重的共沉淀作用。在低浓度的蛋白质严重的共沉淀作用。在低浓度的蛋白质溶液中盐析，用盐量较多，共沉淀少。溶液中盐析，用盐量较多，共沉淀少。一般一般2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。的蛋白质浓度较适中。n离子强度：一般，离子强度越大，蛋白离子强度：一般，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在分离时，一般从低质的溶解度越低。在分离时，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。离子强度到高离子强度顺次进行。影响盐析的因素影响盐析的因素nph ph 值：为提高盐析效率，多将溶液值：为提高盐析效率，多将溶液

5、phph调制目调制目的蛋白的等电点处。的蛋白的等电点处。注意：蛋白质的等电点在注意：蛋白质的等电点在水中或稀盐溶液中与高浓度下测的结果不同。水中或稀盐溶液中与高浓度下测的结果不同。根据实际情况调整根据实际情况调整n温度：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度温度：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏

6、感的可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在酶要求在0-40-4进行。进行。4 4、盐的选择、盐的选择n负离子带电荷较多者，盐析能力较强，负离子带电荷较多者，盐析能力较强，如硫酸钠的盐析能力大于氯化钠。正离如硫酸钠的盐析能力大于氯化钠。正离子带电荷较多者，盐折能力较低，如硫子带电荷较多者，盐折能力较低，如硫酸镁的盐析能力小于硫酸铵。酸镁的盐析能力小于硫酸铵。n 盐的选用还要考虑盐的溶解度，如果盐的选用还要考虑盐的溶解度，如果溶解度低，在溶液中不能达到高浓度，溶解度低，在溶液中不能达到高浓度，其应用就会受到限制。其应用就会受到限制。常用的中性盐是常用的中性盐是硫酸铵硫酸铵优点：优点： 溶

7、解度大：溶解度大：（nh4nh4）2 2so4so4在在00时仍有时仍有70.670.6的溶解度，远远高于其的溶解度，远远高于其它盐类。它盐类。 分离效果好：分离效果好：有的提取液加入有的提取液加入适量硫酸铵适量硫酸铵盐析，一步就可以除去盐析，一步就可以除去7575的杂蛋白，纯的杂蛋白，纯度提高了四倍。度提高了四倍。 有稳定酶与蛋白质结构的作用。有稳定酶与蛋白质结构的作用。 价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。缺点：需脱盐缺点：需脱盐盐析法盐析法硫酸铵溶液饱和度计算硫酸铵溶液饱和度计算n固体法固体法 g= g表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数；表示在一升溶液中需加入固体硫酸

8、铵的克数；s2：表示要达到的百分饱和度，：表示要达到的百分饱和度，s1表示原溶液表示原溶液中的百分饱和度。中的百分饱和度。 硫酸铵溶液饱和度计算表（表硫酸铵溶液饱和度计算表（表2-2）p25n饱和溶液法饱和溶液法533(s1-s2)100-0.3s2（20） 盐析曲线制作盐析曲线制作p26若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化倍数时，选择倍数时，选择48%-65%48%-65%盐饱和分级范围，盐饱和分级范围，则纯化倍数可达则纯化倍数可达3.03.0，而收得率仅为，而收得率仅为75%75%。若生物材料来源困难，主要考虑提高收得若生物材料来源困难，主要考虑提高收得

9、率时，则选择率时，则选择45%-75%45%-75%盐饱和分级范围盐饱和分级范围, ,则收得率可达则收得率可达80%80%，而纯化倍数将小于，而纯化倍数将小于2.42.4。 透析法：透析法：将半透膜制成袋状，将生物大分子将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。平衡为止。 4 4、脱盐、脱盐盐析法

10、盐析法透析法透析法透析袋（半透膜）透析袋（半透膜）蛋白质溶液蛋白质溶液蒸馏水（透蒸馏水（透析液）析液）透析n透析袋的选择与处理：透析袋的选择与处理：n透析液的选择：低离子强度的中性缓冲液。对透析液的选择：低离子强度的中性缓冲液。对含辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的含辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。辅基或保护辅基的试剂。n透析时间：搅拌情况下，样品液与透析体积之透析时间：搅拌情况下，样品液与透析体积之比宜比宜1 1：1010，3 3小时可达平衡。小时可达平衡。 静止状态进行时，样品液与透析体积之比宜静止状态进行时，样品液与透析体积之比宜1 1：2020，过夜。，

11、过夜。脱盐是否彻底，要经常检查。脱盐是否彻底，要经常检查。二、有机溶剂沉淀法二、有机溶剂沉淀法n基本原理：基本原理：一方面，与盐溶液一样有脱水作用。一方面，与盐溶液一样有脱水作用。n 另一方面，能降低溶液的介电常数。另一方面，能降低溶液的介电常数。 溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如介电常数越大，如2020时水的介电常数为时水的介电常数为8080，而乙，而乙醇和丙酮的介电常数分别是醇和丙酮的介电常数分别是2424和和21.421.4，因而向溶液，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂中加入有机溶剂能降低溶液的介电

12、常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。蛋白质溶解度降低而沉淀。制备蛋白质制备蛋白质有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n优点：优点：分辨能力比盐析法高分辨能力比盐析法高 沉淀不用脱盐，过滤比较容易。沉淀不用脱盐，过滤比较容易。n缺点：缺点：对某些具有生物活性的大分子容对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活。易引起变性失活。 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n有机溶剂的选择：有机溶剂的选择： 首先是要首先是要能与水互溶。能与水互溶

13、。 沉淀蛋白质和酶常用的是沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。乙醇、甲醇和丙酮。 沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是淀剂是乙醇。乙醇。1 1）利用表面活性剂）利用表面活性剂( (三氯乙酸三氯乙酸) )或有机溶剂引起或有机溶剂引起变性；变性；2 2）利用对热的不稳定性）利用对热的不稳定性, ,加热破坏某些组分，而加热破坏某些组分，而保存另一些组分；保存另一些组分；3 3）酸碱变性。）酸碱变性。例如：例如：从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶 采用了采用了改变温度改变温度的选择性沉淀法的选择性沉淀法三、选择性沉淀法三、选择性沉淀法

14、制备蛋白质制备蛋白质4 4、聚乙二醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法n聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol,peg) (polyethylene glycol,peg) n实验表明沉淀作用较满意的聚合物是分子质量在实验表明沉淀作用较满意的聚合物是分子质量在4004006000da6000da之间的聚乙二醇。之间的聚乙二醇。 n优点优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高。沉淀效能高。 沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。制备蛋白质制备蛋白质第三节第三节 制备核酸制备核酸 制备核酸时，需要先将制备核酸时，需要先将d

15、nadna蛋白质（蛋白质（dnpdnp）或或rnarna蛋白质（蛋白质（rnprnp）复合物进行复合物进行解聚解聚，设，设法法除去蛋白质和糖除去蛋白质和糖等杂质，然后再通过等杂质，然后再通过沉淀沉淀法法得到核酸。得到核酸。沉淀法沉淀法 制备核酸制备核酸去污剂去污剂n加入适量的加入适量的阴离子去污剂阴离子去污剂（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠sdssds），复合物解聚，释放核酸。），复合物解聚，释放核酸。n加入适量加入适量醋酸钾醋酸钾溶液，使溶液，使sds-sds-蛋白质复合物沉蛋白质复合物沉淀。淀。有机溶剂有机溶剂n利利用用酚、氯仿的混合液酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂。作蛋白质的变性剂。蛋

16、白水解酶蛋白水解酶1 1、dnp/rnpdnp/rnp复合物的解聚、除去蛋白质复合物的解聚、除去蛋白质 多糖多糖 采用采用选择性沉淀剂选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（ctabctab） dna与与rna的分离的分离n盐析法：盐析法：dnadna在在1 12mol/l nacl2mol/l nacl溶液中，溶解度较大；溶液中，溶解度较大； 0.14 mol/l nacl0.14 mol/l nacl溶液中，溶解度极小；溶液中，溶解度极小； rnarna在在0.14 mol/l nacl0.14 mol/l nacl溶液中溶解。溶液中溶解。n酶水解法：酶水

17、解法：在提取在提取dnadna时，可采用时，可采用rnasernase水解水解rnarna杂质。杂质。反之，在提取反之，在提取rnarna时，可采用时，可采用dnasednase水解杂质水解杂质dnadna。制备核酸制备核酸 2 2、多糖等杂质的消除、多糖等杂质的消除 有机溶剂有机溶剂n乙醇盐溶液乙醇盐溶液dnadna：0.1 mol/l nacl0.1 mol/l nacl溶液和溶液和2 2倍体积冷无水乙醇倍体积冷无水乙醇 rnarna：0.1 mol/l nacl0.1 mol/l nacl溶液和溶液和2.52.5倍体积冷无水乙醇倍体积冷无水乙醇 n异丙醇异丙醇dnadna或大分子或大分子

18、rrnarrna：0.3mol/l naac0.3mol/l naac和和0.540.541 1倍体倍体积的异丙醇积的异丙醇 制备核酸制备核酸 3 3、核酸的沉淀核酸的沉淀 核酸的沉淀核酸的沉淀聚乙二醇聚乙二醇n加加聚乙二醇聚乙二醇0.5mol/l nacl0.5mol/l nacl溶液到核酸溶液溶液到核酸溶液中，可使中，可使2kb2kb的的dnadna片段沉淀出来。片段沉淀出来。n聚乙二醇的浓度与聚乙二醇的浓度与dnadna片段的分子质量成反比。片段的分子质量成反比。 1.65kb 1.65kb的的dnadna，用，用5 5pegpeg； 1.2kb1.2kb的的dnadna，用，用6 6pegpeg； 0.6kb0.6kb的的dnadna，用，用7 7