第四章Fluorometry

1、第四章第四章 荧荧 光光 分分 析析 法法 ( (fluorometryfluorometry) )一、一、分子发光的类型分子发光的类型分子发光分子发光分子荧光分子荧光(molecular fluorescence) 分子磷光分子磷光(molecular phosphorescence)化学发光化学发光(chemiluminescence)生物发光生物发光(bioluminescence)二、二、基本原理基本原理1.荧光、磷光的产生及去活化过程荧光、磷光的产生及去活化过程a、基态基态 2 2 b、激发单线态、激发单线态* * c、激发三线态、激发三线态* * 能能量量 * * *a b c 单

2、线态和三线态的电子分布单线态和三线态的电子分布荧光、磷光能级图荧光、磷光能级图s0s1s2t1fp振动驰豫振动驰豫内转换内转换系间跨越系间跨越fp辐辐 射射无辐射无辐射振动驰豫振动驰豫内转换内转换外转换外转换系间跨越系间跨越2. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱a. 荧光物质分子都具有两个特征光谱荧光物质分子都具有两个特征光谱： 激发光谱激发光谱(excitation spectrumexcitation spectrum) 发射光谱发射光谱(fluorescence spectrumfluorescence spectrum) 激发光谱激发光谱：指：指不同激发波长不同激发波长的辐射引起物

3、质发射的辐射引起物质发射某一波长某一波长的相对效率的相对效率。f ex 荧光光谱荧光光谱：表示在所发射的荧光中：表示在所发射的荧光中各种波长各种波长组分组分的相对强度的相对强度. f fl b.激发光谱和荧光光谱的用途激发光谱和荧光光谱的用途v定量分析：在作定量分析时，激发波长和定量分析：在作定量分析时，激发波长和荧光波长应选在最大发射强度所对应的激发荧光波长应选在最大发射强度所对应的激发波长和荧光波长处，分别称为最大激发波长波长和荧光波长处，分别称为最大激发波长和最大荧光波长。和最大荧光波长。v定性分析：在一定条件下，每一种荧光物定性分析：在一定条件下，每一种荧光物质都有两个特征的光谱质都有

4、两个特征的光谱激发光谱和荧光激发光谱和荧光光谱；光谱；c. 光谱特征光谱特征1）stokes shift e=h/ e 最大荧光波长最大荧光波长 最大激发波长最大激发波长2）荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱s0振动能级振动能级s1*振动能级振动能级300400500nmf硫酸奎宁的激发光（红）谱和荧光光谱（蓝）3）. 荧光光谱的形状通常与激发波长无关荧光光谱的形状通常与激发波长无关s0s0s1*s1*s2*s0e.g.3. 荧光产生的条件荧光产生的条件a. 荧光效率（荧光量子产率荧光效率（荧光量子产率 ）= =发射荧光的分子数发射

5、荧光的分子数激发态的分子数激发态的分子数发射的光子数发射的光子数吸收的光子数吸收的光子数b. 荧光与有机物结构的关系荧光与有机物结构的关系 * （ 104）跃迁类型跃迁类型 n * （ 102） * 能产生较强的荧光能产生较强的荧光在具有刚性平面结构的在具有刚性平面结构的 电子共轭体系的分子中电子共轭体系的分子中 电子共轭度电子共轭度分子平面度分子平面度量子产率量子产率荧光越易产生荧光越易产生e.g.联二苯联二苯= 0.2 c芴芴 = 1.0c.c.影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素温度升高，荧光效率和荧光强度将降低；温度升高，荧光效率和荧光强度将降低；溶剂极性越大，荧光波长将会长移

6、；溶剂极性越大，荧光波长将会长移；溶剂粘度越小，荧光强度越小；溶剂粘度越小，荧光强度越小；phph值的影响，荧光物质都有它最适宜的值的影响，荧光物质都有它最适宜的phph范围范围; ;荧光熄灭剂的影响荧光熄灭剂的影响散射光的干扰散射光的干扰4. . 定量分析方法定量分析方法a. 荧光强度与荧光物质的关系荧光强度与荧光物质的关系if = k1（i0-i）ii0= 10-bcif = 2.3k1 i0 bcbc0.05i0一定if = kc式中表明式中表明：（if只与只与i0有关有关）i0if紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法i0ii0不一定不一定灵敏度灵敏度：荧光法荧光法 紫外可见分光光度法紫

7、外可见分光光度法b. 定量方法定量方法标准曲线法：标准曲线法：c if cx ifx 比例法：比例法：csifs ifo = k csifx - ifo = k cxcx =ifx ifoifs - ifo三、三、荧光分析仪器荧光分析仪器光源光源第一单色器第一单色器样品池样品池第二单色器第二单色器检测器检测器放大器和放大器和记录仪记录仪i0if四、四、荧光新技术荧光新技术激光荧光分析（光源：激光）；激光荧光分析（光源：激光）；时间分辨荧光分析（荧光寿命的差异）；时间分辨荧光分析（荧光寿命的差异）；同步荧光分析（选择波长差值，同时扫描两波谱）同步荧光分析（选择波长差值，同时扫描两波谱）胶束增敏荧

8、光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析胶束溶液胶束溶液表面活性剂溶液表面活性剂溶液亲水集团（极性）亲水集团（极性）疏水集团（非极性疏水集团（非极性）胶束直径胶束直径：3-6nm（胶体溶液胶体溶液）胶束溶液对荧光物质的作用胶束溶液对荧光物质的作用增溶增溶增稳增稳增敏增敏水溶液中的正胶束水溶液中的正胶束极性极性非极性非极性作用原理作用原理 非极性的有机物与胶束的非极性尾部有亲和作用，使荧光分子非极性的有机物与胶束的非极性尾部有亲和作用，使荧光分子定位于胶束的亲脂性内核中，这也对荧光分子起到了一定的保护作定位于胶束的亲脂性内核中，这也对荧光分子起到了一定的保护作用，减弱了荧光质点之间

9、的碰撞，减少了分子的无辐射跃迁，增加用，减弱了荧光质点之间的碰撞，减少了分子的无辐射跃迁，增加了荧光效率，从而增加了荧光强度。了荧光效率，从而增加了荧光强度。五、五、化学发光分析法化学发光分析法化学发光（化学发光（chemiluminescencechemiluminescence）：）： 不是由不是由光、热和电能光、热和电能而是由化学反应激而是由化学反应激发物质所产生的光辐射发物质所产生的光辐射1. 化学发光分析的基本原理化学发光分析的基本原理a + b c* + dc* c +h 化学发光反应的条件：化学发光反应的条件：化学反应必须快速放出足够的能量，而这一化学能化学反应必须快速放出足够的

10、能量，而这一化学能又能被反应分子吸收，形成一种激发态的产物；又能被反应分子吸收，形成一种激发态的产物；处于激发态的分子或原子必须能释放出光子，或者处于激发态的分子或原子必须能释放出光子，或者能够转移它的能量到另一分子上而使此分子被激发，能够转移它的能量到另一分子上而使此分子被激发，当这一分子再回到基态时释放出光子。当这一分子再回到基态时释放出光子。2. 化学发光的类型化学发光的类型气相化学发光气相化学发光液相化学发光液相化学发光3. 化学发光分析仪器化学发光分析仪器进样方式进样方式分立取样式分立取样式流动注射式流动注射式分立取样式分立取样式反应室反应室光电倍增管光电倍增管高压电源高压电源放大器放大器显示器显示器优点：优点：可以记录化学发光反应的全过程，可以记录化学发光反应的全过程， 适用于反应动力学研究适用于反应动力学研究流动注射式流动注射式光电倍增管光电倍增管高压电源高压电源记录仪记录仪wabpsvf优点：优点：易操作，重现性好，可控制进样量和易操作，重现性好，可控制进样量和 进样速度。进样速度。荧光法的基本原理（荧光、磷光的发生过程）、荧光法的基本原理（荧光、磷光的发生过程）、激发光谱和荧光光谱、分