分子生物学第四章

1、理论上三大发现理论上三大发现技术上三大发明技术上三大发明 遗传物质是遗传物质是dna dna双螺旋结构双螺旋结构 遗传信息传递方式遗传信息传递方式 工具酶工具酶 载体载体 转录酶转录酶1973年年 以以dna重组实验成功为标志重组实验成功为标志现代分子生物学现代分子生物学跨越天然物种屏障跨越天然物种屏障定向创造新物种定向创造新物种工具酶工具酶基因基因载体载体受体细胞受体细胞必要条件必要条件操作过程操作过程 获得获得外源基因（目的基因外源基因（目的基因/ /目的片段）目的片段） 与载体进行体外与载体进行体外重组重组形成重组体（重组子）形成重组体（重组子） 将重组体将重组体导入导入（转化（转化/

2、/转导转导/ /转染）受体细胞转染）受体细胞 细胞扩增和细胞扩增和筛选筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞含有重组体的受体细胞（宿主细胞/ /寄主细胞）寄主细胞） 培养含有重组体的细胞（阳性克隆）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测检测表达产物表达产物dna聚合酶聚合酶 dna polymerase逆转录酶逆转录酶 reverse transcriptaset4多核苷酸酶多核苷酸酶 t4 polymerase kinase碱性磷酸酶碱性磷酸酶 alkalinephosphatase活性定义活性定义限制酶的一个活性单位（限制酶的一个活性单位（1u），原则），原则上是在上是在50l的反应液中，的反应

3、液中，37的温的温度条件下，经过度条件下，经过1小时反应，将小时反应，将1gdna完全分解所需要的酶量。完全分解所需要的酶量。特点特点 识别部位序列一识别部位序列一般为般为4、5或或6个核苷个核苷酸序列；酸序列； 呈双重轴对称。呈双重轴对称。性质性质切断识别部位或其附近特定部切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（平齐末端和粘性末端（5突突出端和出端和3突出端）。突出端）。pst ictgcaggacgtcecor i3突突出出5突突出出同裂酶同裂酶isoschizomer指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。指来源不同，但有相同识别序列

4、的限制性内切酶。 同尾酶同尾酶isocaudamer指识别序列不同，但切割指识别序列不同，但切割dna后可以产生相同粘端的后可以产生相同粘端的限制性内切酶。限制性内切酶。 dna连接酶可以催化单链连接酶可以催化单链dna的连接吗？的连接吗？dna连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？主要连接酶的功能特点主要连接酶的功能特点最常用连接酶最常用连接酶t4dna lingasee.coli.dna lingase平齐末端双链平齐末端双链dna分子的连接分子的连接功能功能有有无无匹配粘性末端双匹配粘性末端双链链dna分子的连分子的连接功能接功能有有有有辅助因子

5、辅助因子atpnad+p载体和插入片段载体和插入片段容易连接成环状的重组容易连接成环状的重组dnadna分子分子可能出现问题：可能出现问题：载体自身环化载体自身环化，造成假阳性背景克隆；，造成假阳性背景克隆；插入片段可插入片段可双向插入双向插入；插入片段可插入片段可多拷贝插入多拷贝插入。p当当dnadna片段两端为片段两端为可实现定向克隆可实现定向克隆，连接效率高，简捷，连接效率高，简捷粘性末端连接粘性末端连接可在连接前，用碱可在连接前，用碱性磷酸酶将载体性磷酸酶将载体dna 5端去磷酸端去磷酸化，这样只有载体化，这样只有载体和插入片段之间才和插入片段之间才能发生连接；能发生连接；利利用用磷磷

6、酸酸酶酶防防止止载载体体dnadna的的重重新新环环化化。 质粒载体的定向克隆质粒载体的定向克隆基因工程常用工具酶基因工程常用工具酶作作 用用限制性内切酶限制性内切酶识别识别dna特定序列，切割特定序列，切割dna链链dna聚合酶聚合酶i或大片段或大片段klenow fragment1、切口平移制作标记、切口平移制作标记dna探针；探针；2、合成、合成cdna第二第二条链；条链；3、填补双链、填补双链dna3凹端；凹端；4、dna序列分析序列分析dna连接酶连接酶连接两个连接两个dna分子或片断分子或片断taq dna聚合酶聚合酶聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（pcr）逆转录酶逆转录酶合成合成

7、cdna第一条链第一条链t4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多核苷酸催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 末端加入同质多聚物尾末端加入同质多聚物尾s1核酸酶、绿豆核酸核酸酶、绿豆核酸酶酶降解单链降解单链dna或或rna，使双链，使双链dna突出段变为平端突出段变为平端dna端酶端酶i降解降解dna，在双链，在双链dna上产生随机缺口上产生随机缺口rna酶酶a降解除降解除rna e.coli. dna聚合酶聚合酶i e.coli. dna聚合酶聚合酶i大片段大片段（klenow fragment） t4噬菌体噬菌体dna聚合酶聚合酶

8、 t7噬菌体噬菌体dna聚合酶聚合酶 耐高温耐高温dna聚合酶：聚合酶： taq dna聚合酶聚合酶dna polymerasereverse transcriptasealkalinephosphataset4 polymerase kinase 细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶bap 牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶cip是能够携带外源是能够携带外源dna进入宿主细胞进行扩进入宿主细胞进行扩增和表达的增和表达的dna,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成的。等构建而成的。质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒组 合 载组 合 载体体种种 类类 p能在宿主细胞

9、中独立复制能在宿主细胞中独立复制;p具有多种限制酶的单一切点（多克隆具有多种限制酶的单一切点（多克隆位点）以便外源位点）以便外源dna插入；插入；p具有筛选标记具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组以区别阳性与阴性重组分子分子;p分子较小，便于体外基因操作，同时分子较小，便于体外基因操作，同时载体载体dna与宿主与宿主dna便于分离；便于分离；p表达载体表达载体: :具有与宿主细胞相适应的具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。元件。必要条件必要条件具备条件具备条件分类分类 克隆载体：克隆载体：以繁殖以繁殖dnadna为目的的载体，通常为目的

10、的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如pbr322pbr322、pucpuc、m13m13等。等。穿梭载体：穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞带有两种复制原点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆。核基因的克隆。表达载体：表达载体：以获得基因表达产物为目的的载以获得基因表达产物为目的的载体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数高和能在宿主细胞中高效表达等特点。高和能在宿主细胞中高效表达等特点。克隆载体的特性克隆载体的特性 复制起始：在受体细

11、胞中独立复制复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性，其他遗传标记多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源分子量小：能容纳的外源dnadna片段尽可能大片段尽可能大 常用克隆载体常用克隆载体 质粒质粒 噬菌体噬菌体 cosmidcosmid phagemid phagemid 真核病毒真核病毒 yac, bacyac, bac分类分类松弛型松弛型* *独立复制，拷贝数高独立复制，拷贝数高, 10-200个个拷贝拷贝/细胞，例如细胞，例如puc载体可达载体可达700个个/细胞细胞严紧型严紧型受受体染色体受受体染色体dna复制控制，拷复制控制，拷贝数低，贝数低，1-几个拷贝几个拷贝/细胞，例如细胞，例如psc101天然型天然型人工型人工型* *可转移型可转移型不可转移型不可转移型* *氯霉素扩增氯霉素扩增氯霉素可抑制染氯霉素可抑制染色体色体dnadna复制，但质粒复制不受影复制，但质粒复制不受影响，可增