第五章酶与细胞的固定化

1、第五章第五章 酶与细胞定化酶与细胞定化 固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme）是）是20世纪世纪60年代年代发展起来的一项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性发展起来的一项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分水不溶的载体上，或将酶

2、束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。过去曾称其。过去曾称其为水不溶酶或固相酶。为水不溶酶或固相酶。1971年第二届国际酶工程会上正式年第二届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。建议采用固定化酶的名称。 从从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，而且已转向它在工业、医方法和载体开发有了长足发展，而且已转向它在工业、医学、化学分析、亲和层析、环

3、境保护、能源开发以及理论学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。研究等方面的应用研究。第一节第一节 酶和菌体固定化酶和菌体固定化 一、固定化酶与固定化细胞的优缺点一、固定化酶与固定化细胞的优缺点 1.固定化酶的优点： （1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。中没有酶的残留，简化了提纯工艺。 (2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。续化、管道化。 （3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化）酶反应过程可以严格控制，有利于

4、工艺自动化和微电脑化。和微电脑化。 （4）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 （5）较能适应于多酶反应。）较能适应于多酶反应。 （6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。有保障，成本低。 2.固定化酶的缺点固定化酶的缺点:（1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。）比较适应水溶性底物和小分子底物。（3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特）与完整细胞比较

5、，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。离后，才能固定化。 3固定化细胞的优点固定化细胞的优点 (1)省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快、而且多、反应快。细胞生长快、而且多、反应快。 (3) 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。产物抑制和消耗。 (4) 保持酶在细胞

6、内的原始状况，增加了酶的稳定，特别保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定，特别是对污染因子的抵抗力增加。是对污染因子的抵抗力增加。 4.固定化细胞的缺点：（1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。（2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。（3）细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 二、酶的固定化方法二、酶的固定化方法酶的固定化方法有：1.吸附法2.共价键结合法3.交联法4.包埋法 （图5-1）。 1.吸附法吸附法吸附法分为吸附法分为物理吸附法物理吸附法和和离于交换吸附法离于交换吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法 通过氢键、疏水

7、作用和通过氢键、疏水作用和电子亲电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而制成固定化酶。制成固定化酶。常用的载体有：常用的载体有： （1）有机载体）有机载体 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等 （2）无机载体）无机载体 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 2离子交换吸附法离子交换吸附法 这是将酶与含有离子交换基这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇

8、具广泛的用途。常用的载体吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（deaedeae）- -纤纤维素、混合胺类（维素、混合胺类（ectedlaectedla）- -纤维素、四乙氨基乙纤维素、四乙氨基乙基（基（teaeteae）- -纤维素、纤维素、deae-deae-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、amberlite ira-93amberlite ira-93、410410、900900等。阳离子交换剂等。阳离子交换剂基，如羧甲基（基，如羧甲基（cmcm）- -纤维素、纤维素柠檬酸盐、纤维素、纤维素柠檬酸盐、amberlite cg

9、50amberlite cg50、irc-50irc-50、ir-200ir-200、dowex-50dowex-50等。等。 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化聚合物中以达到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细

10、胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。四、包埋法四、包埋法1.凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。 n（1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 n（2）辐射包埋法 n（3）其他凝胶包埋法 2微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可囊内。它使酶存在于类似细胞

11、内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性，同时，小分子底物能从而增加了酶的稳定性，同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微胶囊微胶囊的制备方法有的制备方法有5种。种。微胶囊的制备方法：微胶囊的制备方法：（1）界面沉淀法（2）界面聚合法（3）液体干燥法（4）红血球包埋法（5）脂质体包埋法五、共价键结台法五、共价键结台法 共价键结合法 是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手

12、续亦较繁琐。 （一）酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种： （1）酶蛋白n-端的a-氨基或赖氨酸残基的-氨基。 （2）酶蛋白c-端的羧基以及asp残基的-羧基和glu残基-羧基。 （3）cys残基的巯基。 （4）ser、tyr、thr残基的羟基。 （5）phe和tyr残基的苯环。 （6）his残基的咪唑基。 （7）trp残基的吲哚基。 （二）载体的选择（二）载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是： （l）一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。 （2）载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。

13、（3）载体必须带有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 （4）载体没有或很少有非专一性吸附。 （5）载体来源容易，便宜，并能反复使用。 第二节第二节 微生物，植物和动物细胞的固定化微生物，植物和动物细胞的固定化n 菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋包埋法法、吸附法吸附法和和不用载体法不用载体法等。等。n 一、包理法一、包理法n 包埋法包埋法是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉

14、胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。发挥酶或酶系的作用。19771977年我国投人生产的固定化青霉年我国投人生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆菌而成。美国、素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆菌而成。美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化酶大体相似酶大体相似 。n包埋法：n1聚丙烯酰胺凝胶包埋法 n2琼脂凝胶包埋法n3海藻

15、酸包埋 法n4卡拉胶包埋法 n5明胶包埋法 二、吸附法二、吸附法n吸附法：n1.物理吸附法 将微生物细胞附着个固体载体上的一种固定方法。n2.离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离子交换树脂。 n 三、不用载体法三、不用载体法n这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生内的一种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至物细胞加热至6060，10min10min，其他酶失活，则该酶被固，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞定在细胞内，所以又称加热固定

16、化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚后干燥即成固定化细胞。使之凝聚后干燥即成固定化细胞。 n二、植物细胞固定化n 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代年代开始研究，目前，一般采用开始研究，目前，一般采用吸附法吸附法和和包埋法包埋法 n1.吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及o2在中空纤维管内流动，透过中空纤维管壁（具半透膜性），传递给附着于

17、外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭菌后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。n2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉莱胶等多孔凝胶中。bredelius等(1979）首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞。毛地黄细胞、海巴朝细胞。三、动物细胞固定化三、动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸附

18、法的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。和包埋法两种，其中吸附法用的最多。 1吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。 主要载体及固定方法有：主要载体及固定方法有： (1)转瓶法 (2)微载体法 (3)中空纤维法包埋法包埋法 包埋法根据载体与方法不同：包埋法根据载体与方法不同： 1.凝胶包埋法 2.半透膜包埋法第三节 原生质的固定化n 如前所述，固定化细胞可以取代游离细胞进行发酵，如前所述，固定化细胞可以取代游离细胞进行发酵，生产种有用物质，并具有许多显著的优点。然而固定生产

19、种有用物质，并具有许多显著的优点。然而固定化细胞也有其缺点，例如，固定化细胞只能用于生产化细胞也有其缺点，例如，固定化细胞只能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物；而且由于载胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物；而且由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制；体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制；尤其是在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关尤其是在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。为探讨解决这些问题的方法，很多键性的限制因素。为探讨解决这些问题的方法，很多人从不同的角度进行研究。人从不同的角度进行研究。n 细胞产生的许多代谢产物之所以不能分泌到胞外

20、,原因是多方面的,其中细胞壁对物质扩散的障碍是其原因之一。因此,若能够去除微生物细胞和植物细胞的细胞壁,就有可能增加细胞膜的透过性,从而使较多的胞内物质分泌到细胞外。一、原生质体的制备n要进行原生质体固定化要进行原生质体固定化,必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体。同时要在破坏细胞壁的时候破坏而分离出原生质体。同时要在破坏细胞壁的时候,不能影响到不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏,为此只能使为此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。用对细胞壁有专一性作用的酶。n不同种类的细胞不同

21、种类的细胞,由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同，由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同，原生质体的制备方法也不一样。一般说来，原生质体的制备过程原生质体的制备方法也不一样。一般说来，原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来是首先将对数生长期的细胞收集起来,悬浮在含有渗透压稳定剂的悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加人适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下高渗缓冲液中。然后加人适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片，未作用的作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片，未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。细胞以及细胞壁水解酶，而

22、得到原生质体。二、原生质体固定化n 原生质体制备好后，把离心收集到的原生原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然后采用包配成一定浓度的原生质体悬浮液。然后采用包埋法制成固定化原生质体。埋法制成固定化原生质体。n原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有用的凝胶有: :琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下: : 1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 用生理盐水配制

23、用生理盐水配制3%3%4%4%的琼脂，加热的琼脂，加热溶解灭菌后，至溶解灭菌后，至5050左右，与等体积的左右，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋酸纤维液用滴管滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上素上, ,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。固定化原生质体。 2.海藻酸钙凝胶固定化法 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度的制一定浓度的(3%(3%6%)6%)海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液, ,与与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混等体积的一定浓度的原生质体悬浮液

24、混合均匀合均匀, ,将此混悬液用滴管或注射器滴到将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中一定浓度的氯化钙溶液中, ,浸泡浸泡1 12h,2h,制制成直径为成直径为1 14mm4mm的球状固定化原生质体。的球状固定化原生质体。 3.角叉菜胶固定化法 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度制一定浓度(3%(3%8%)8%)的角叉菜胶的角叉菜胶, ,加热溶加热溶解解, ,灭菌后灭菌后, ,冷却至冷却至5050左右左右, ,与等体积的与等体积的原生质体悬浮液混合均匀原生质体悬浮液混合均匀, ,将混悬液滴到将混悬液滴到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中一定浓度的预冷的

25、氯化钾溶液中, ,制成球制成球状固定化原生质体。状固定化原生质体。 4.光交联树脂固定化法 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制30%30%60%60%浓度的光交联树脂预聚体浓度的光交联树脂预聚体, ,加热溶解加热溶解后后, ,在在5050左右左右, ,加人加人1%1%光敏剂光敏剂, ,与等体积的原与等体积的原生质体悬浮液混合均匀生质体悬浮液混合均匀, ,摊成薄层摊成薄层, ,经紫外光照经紫外光照射射2 23mm,3mm,聚合后切成一定形状的小块聚合后切成一定形状的小块, ,制成片制成片状固定化原生质体。状固定化原生质体。 此外也可选用其他适宜的凝胶或中空纤维为载此

26、外也可选用其他适宜的凝胶或中空纤维为载体，制备固定化原生质体。体，制备固定化原生质体。三、固定化原生质体的应用三、固定化原生质体的应用 固定化原生质体一方面保持了细胞原有的固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发产物而在发酵液中获得所需的发产物,为胞内物质为胞

27、内物质的工业化生产开辟了新途径。的工业化生产开辟了新途径。 固定化原生质体具有下列特点固定化原生质体具有下列特点: : (1)(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障屏障, ,可增加细胞膜的通透性可增加细胞膜的通透性, ,有利于氧气和营养物质有利于氧气和营养物质的传递和吸收的传递和吸收, ,也有利于胞内物质的分泌也有利于胞内物质的分泌, ,可显著提高可显著提高产率。产率。 (2)(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用固定化原生质体由于有载体的保护作用, ,具有具有较好的操作稳定性和保存稳定性较好的操作稳定性和保存稳定性, ,可反复使用或连续可反复

28、使用或连续使用较长的时间使用较长的时间, ,利于连续化生产。在冰箱保存较长利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。时间后仍能保持其生产能力。 (3)(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开固定化原生质体易于和发酵产物分开, ,有利于产物的分离纯化有利于产物的分离纯化, ,提高产品质量。提高产品质量。 (4)(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂添加渗透压稳定剂, ,以保持原生质体的稳定性。以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后这些渗透压稳定剂在发酵结束后, ,可用层析或可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。膜分离技术等方法与产物分离。 固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。现举例如下: 1.1.氨基酸的生产氨基酸的生产 19821982年日本东京工业大学以琼脂多孔蜡酸纤维年日本东京工业大学以琼脂多孔蜡酸纤维素固定化黄色短杆菌原生质体素固定化黄色短杆菌原生质体, ,用于生产谷氨酸的研用于生产谷氨酸的研究。结果表明，由于解除了细胞壁的扩散障碍，有利究。结果表明，由于解除了细胞壁的扩散障碍，有利于谷氨酸分泌到胞外，提高谷氨酸产率。固定化原生于谷氨酸分泌到胞外