第十一讲PCR技术

1、分子杂交分子杂交 一、一、 southern杂交杂交二二 、northern杂交杂交三、三、 菌落原位杂交菌落原位杂交四四 、western杂交杂交一、一、southern杂交杂交 这种方法是这种方法是e.m.southern1975年建立年建立,是进行基因组是进行基因组dna特定序列定位的通用方法。特定序列定位的通用方法。southern杂交可用来杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的检测经限制性内切酶切割后的dna片段中是否存在与片段中是否存在与探针同源的序列。探针同源的序列。 【原理】【原理】 southern杂交是分子生物学的经典实验方法。其基杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是

2、将待检测的本原理是将待检测的dna样品固定在固相载体上样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的在与探针有同源序列的固相固相dna的位置上显示出杂交信号。通过的位置上显示出杂交信号。通过southern杂交可以判断被检测的杂交可以判断被检测的dna样品中是否有与探针同样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。源的片段以及该片段的长度。 southern blottingsouthern blotting的过程的过程1.1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的dnadna2.2.通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳液的移动转

3、移胶中的dnadna3.3.固定固定dnadna4.4.预杂交和杂交预杂交和杂交( (放射性和荧光检测放射性和荧光检测) )5.5.结果检测结果检测（一）（一）southern杂交的操作步骤杂交的操作步骤1.预处理：预处理： （1）用限制性内切酶将基因组）用限制性内切酶将基因组dna进行酶切。进行酶切。 （2）将酶切后的）将酶切后的dna片段进行琼脂糖凝胶电泳。片段进行琼脂糖凝胶电泳。 （3）将电泳出来的那块凝胶泡在）将电泳出来的那块凝胶泡在强碱溶液强碱溶液中，此时中，此时双链的双链的dna样品变成单链样品变成单链dna结构结构。 （4）用）用酸中和，使单链酸中和，使单链dna维持其单链状态维

4、持其单链状态2.原位转移：原位转移： 将凝胶上的单链将凝胶上的单链dna转移到滤膜上。转移到滤膜上。3.固定：固定： 在真空烤箱里，在真空烤箱里，80下烤下烤1-3h。将核酸样品进一步固定在滤。将核酸样品进一步固定在滤膜上膜上4.杂交：杂交： 将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链上的单链dna分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。杂种分子。5.漂洗：漂洗： 将滤膜上没有和单链将滤膜上没有和单链dna样品结合的游离的探针分子漂洗下样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤

5、膜上只有杂交分子。来，此后滤膜上只有杂交分子。6.放射自显影：放射自显影： 在在x光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。7.比较鉴定：比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的探针分子结合的dna分子是凝胶上分子是凝胶上dna链的那个片段。链的那个片段。放射自显影放射自显影dna印迹转移印迹转移探针杂交探针杂交 southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性在理想的条件下，应用放射

6、性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的的dna也能被清晰地检测出来。也能被清晰地检测出来。 1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合dna的，的，这种结这种结合并不十分牢固合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，随着杂交及洗膜进程，dna会慢会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降

7、。慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。（二）（二）southern杂交的杂交滤膜杂交的杂交滤膜（2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎须小心谨慎 (特别是经烘烤后特别是经烘烤后)。（3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合低盐浓度时结合dna效果不佳，不适宜于电转印迹法。效果不佳，不适宜于电转印迹法。（4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的dna片段片段 (特别特别是小于是小于200bp的的dna片段片段)结合能力不强。结合能力不强。

8、2. 尼龙膜尼龙膜优点：优点： 结合结合dna和和rna的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。分子质量的核酸也能较好地结合。 尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。可重复用于杂交。缺点：缺点： 杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。northern印迹杂交（印迹杂交（northern blot）。这是一种将）。这是一种将rna从从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。dna印迹印迹技术由技术由souther

9、n于于1975年创建，称为年创建，称为southern印迹技术，印迹技术，rna印迹技术正好与印迹技术正好与dna相对应，故被称为相对应，故被称为northern印印迹杂交迹杂交 【northern印迹杂交】印迹杂交】将将rna分子分子从电泳凝胶转移到硝从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。交的一种实验方法。二、northern杂交northern 印迹杂交的印迹杂交的rna吸印与吸印与southern印迹杂交的印迹杂交的dna吸吸印方法类似，印方法类似，只是在进样前只是在进样前用用甲基氢氧化银、

10、乙二醛或甲醛使甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使rna变性变性，而不用，而不用naoh，因为它会水解，因为它会水解rna的的2-羟基基团。羟基基团。rna变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以以在转印后用在转印后用低盐缓冲液洗脱低盐缓冲液洗脱，否则，否则rna会被洗脱。会被洗脱。在在胶中不能加胶中不能加eb，因为它会影响，因为它会影响rna与硝酸纤维素膜的结合。与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳

11、，为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行northern转印。转印。（一）（一） 探针准备探针准备dig标记的标记的rna探针与探针与dna探针相比，显示较强的杂交信探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用rna探针探针可以比可以比dna探针获得更好的杂交结果。如果必须使用探针获得更好的杂交结果。如果必须使用dna探针，建议使用高探针，建议使用高sds杂交缓冲液或杂交缓冲液或dig easy hyb高效杂高效杂交缓冲液，以减少

12、背景。交缓冲液，以减少背景。 northern杂交的方法杂交的方法在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1l/ ml、3l/ ml、5l/ ml ），可观察到背景颜色的浓度即可作为），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用cspd化学发光检测化学发光检测时，建议试验探针浓度时，建议试验探针

13、浓度50100ng/ml，如果采用，如果采用cdp-star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。 （二）（二） 印迹条件印迹条件对于对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10和和20的的ssc盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在间是在4或室温下过夜。或室温下过夜。（三）（三） northern转膜转膜转膜前的转膜前的rna琼脂糖凝胶电泳参照琼脂糖凝胶电泳参照rna分离中的电泳方

14、法，分离中的电泳方法，根据需要选用适当的根据需要选用适当的 分子量分子量marker.1在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用dmpc-h2o淋淋洗，以除去甲醛，然后置于洗，以除去甲醛，然后置于 2ssc（20ssc用用dmpc-h2o稀释）中浸泡稀释）中浸泡1530min.。2构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，倍的滤纸，将其横放在玻璃

15、板上，滤纸两头垂入盘中，用用20ssc浸湿滤纸，并向盘中加入足量的浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20ssc。3用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。胶四周边缘，避免覆盖样品部位。4剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无rnase的的水中浸泡水中浸泡5min.，然后将其放置

16、在凝胶上面，膜的一条边缘，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。 5取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20ssc浸湿后置浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜板上压一重物，室温下转膜46小时或小时或

17、4过夜。过夜。在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20ssc，当纸，当纸巾浸湿后，要及时更换。巾浸湿后，要及时更换。6拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。 7取下凝胶，用取下凝胶，用2ssc洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。8交联：交联：方法（方法（1）将膜夹于两张滤纸之间，在）将膜夹于两张滤纸之间，在80真空烘烤真空烘烤0.52小时；小时；方法（方法（2）将膜置

18、于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有）将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有rna的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进龙膜适度照射可促进rna上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使rna上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。信号减弱。9转膜效果检测：如果需要，可对转移上转膜效果检测：如果需要，可对转移上rn

19、a的膜进的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，冰醋酸中，于室温浸泡于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡下浸泡510min.。可见明显的。可见明显的5s和和18s两条两条rna带，带，mrna呈现模糊带型。呈现模糊带型。 （四）杂交（四）杂交建议杂交条件：探针浓度建议杂交条件：探针浓度50100ng/ml，温度，温度68过夜。过夜。1将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每将印迹膜置于装有预杂交液的杂交袋中（每100cm2膜膜20ml预杂交液），封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂预杂交液）

20、，封好杂交袋，在设定的杂交温度下预杂交至少交至少1小时。小时。2将探针在沸水浴中变性将探针在沸水浴中变性10min.(探针一经变性，立即使探针一经变性，立即使用用)，用预杂交液稀释成设定浓度。，用预杂交液稀释成设定浓度。3将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的将杂交袋中预杂交液弃去，加入稀释好的含有探针的杂交液，在设定杂交温度条件下（杂交液，在设定杂交温度条件下（68）杂交过夜。）杂交过夜。4杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可沸水浴的试管中，贮存于的试管中，贮存于-70以备重复使用。重复使用时，解冻以备重复使用。重复使用时，解冻并

21、在并在68下变性下变性10min.。5洗膜：杂交膜取出后用洗膜：杂交膜取出后用2洗膜缓冲液室温下洗膜洗膜缓冲液室温下洗膜2次，次，每次每次15min.，除去非结合探针以减少背景。接下来用，除去非结合探针以减少背景。接下来用0.5洗膜缓冲液洗膜洗膜缓冲液洗膜2次，每次次，每次15min.，洗膜温度，洗膜温度42，然后再，然后再在在0.1洗膜缓冲液中洗膜洗膜缓冲液中洗膜2次，每次次，每次15min.，洗膜温度，洗膜温度68。当探针长度小于当探针长度小于100bp时，最后一次的洗膜温度要经过预备时，最后一次的洗膜温度要经过预备试验确定。试验确定。三三 菌落原位杂交菌落原位杂交 （colony in

22、situ hybridization）1975年，年，m.grunstein和和d.hosnese根据检测重组子根据检测重组子dna分子的核酸杂交技术原理分子的核酸杂交技术原理,对对southern印迹技术作了一些印迹技术作了一些修改修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使经溶菌和变性处理后使dna暴露出来并与滤膜原位结合暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性再与特异性dna探针探针杂交杂交,筛选出含有插入序列的菌落。筛选出含有插入序列的菌落。四、western杂交 是

23、将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达的特异性表达蛋白。蛋白。 western免疫印迹（免疫印迹（western blot）是将蛋白质转移到膜上，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。抗体检测。step 1. antibody recogni

24、tionof target protein/antigenstep 2. secondary antibodyrecognition of primary abstep 3. color development1. 收集蛋白样品收集蛋白样品(protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚

25、细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。 western blot 实验步骤实验步骤 2. 电泳电泳(electrophoresis) (1) sds-page凝胶配制凝胶配制 sds-page凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可使凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可使用用sds-page凝胶配制试剂盒。凝胶配制试剂盒。 (2) 样品处理样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的sds-page蛋白上样蛋白上样缓冲液。例如缓冲液。例如2x或或5x的的sds-page蛋白上样缓冲液。蛋白上样缓冲液。 100或沸水浴

26、加热或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。分钟，以充分变性蛋白。 （3) 上样与电泳上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔胶加样孔内即可。内即可。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于bio-rad的标准电的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100v，高电压，高电压可以设置在可以设置在120v左右。电泳时间为左右。电泳时间为9012

27、0分钟左右。分钟左右。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。经被适当分离后即可停止电泳。3. 转膜转膜(transfer) 在在western实验中选用实验中选用pvdf膜膜(ffp30/ffp33)或硝酸纤维或硝酸纤维素膜素膜(nc膜膜)(ffn06/ffn09) ，但硝酸纤维素膜比较脆。，但硝酸纤维素膜比较脆。 通常如果使用通常如果使用bio-rad的标准湿式转膜装置，可以设定转的标准湿式

28、转膜装置，可以设定转膜电流为膜电流为300-400ma，转膜时间为，转膜时间为30-60分钟。也可以在分钟。也可以在15-20ma转膜过夜。转膜过夜。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以用丽春红染色液转膜的效果可以用丽春红染色液(p0022)对膜进行染色，以对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。观察实际的转膜效果。4. 封闭封闭(blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的转膜完毕后，立即把蛋白膜放

29、置到预先准备好的western洗涤液中，漂洗洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。则极易产生较高的背景。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，加入用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，加入western封封闭液，在摇床上缓慢摇动闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭室温封闭60分钟。对于一些背景分钟。对于一些背景较高的抗体，可以较高的抗体，可以4封闭过夜。封闭过夜。5. 一抗孵育一抗孵育(primary antibody inc

30、ubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用参考一抗的说明书，按照适当比例用western一抗稀释液一抗稀释液稀释一抗。稀释一抗。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或的一抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以果一抗孵育一小时效果不佳，可以4缓慢摇动孵育过夜。缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。 回收一抗。加入回收一抗。加入western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤液，在

31、侧摆摇床上缓慢摇动洗涤洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。分钟。共洗涤共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。加洗涤次数。 6. 二抗孵育二抗孵育(secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书，按照适当比例用参考二抗的说明书，按照适当比例用western二抗稀释液稀二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶释辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗。标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的择，例如，一抗是小鼠来

32、源的igg，则二抗需选择抗小鼠，则二抗需选择抗小鼠igg的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或二抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入回收二抗。加入western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共分钟。共洗涤洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并

33、增加洗次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。涤次数。7. 蛋白检测蛋白检测(detection of proteins) 将滤膜放在将滤膜放在100ml新配置的新配置的dab溶液中，大约溶液中，大约2-3分钟即分钟即可显色，用水冲洗终止反应，照相。可显色，用水冲洗终止反应，照相。 结果分析：分析阳性显色条带的分子量大小，而且根据结果分析：分析阳性显色条带的分子量大小，而且根据信号强弱分析蛋白表达量。信号强弱分析蛋白表达量。 southern印迹法印迹法(dna印迹法印迹法,southern blotting)：是是一种把一种把dna电泳分离区带转移到支持膜上的技术。电泳分离区

34、带转移到支持膜上的技术。因这一技术是英国科学家因这一技术是英国科学家e.m.southern首先创建的，首先创建的，而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相似，所以用他的姓氏命名为似，所以用他的姓氏命名为southern印迹法。印迹法。 杂交小结杂交小结 northern印迹法印迹法(rna印迹法印迹法,northern blotting)：alwine等人将等人将southern印迹法应用于印迹法应用于rna，原理与，原理与southern印迹法相似。印迹法相似。alwine等人根据命名等人根据命名southern印印迹法的姓氏中含有迹法的

35、姓氏中含有“南部南部” 之意，风趣地把他们的之意，风趣地把他们的rna印迹法称为印迹法称为“北部北部”印迹法（印迹法（northern blotting）。）。 western印迹法（蛋白质印迹法，印迹法（蛋白质印迹法，western blotting）：）：是一是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。人们把这种种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。人们把这种以电驱动为转移方式的蛋白质印迹法诙谐地称为以电驱动为转移方式的蛋白质印迹法诙谐地称为“西部西部”印印迹法（迹法（western blotting）。）。 eastern印迹法（印迹法（eastern blotting）：是是we

36、stern blotting的的变形，对变形，对双向电泳双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为后蛋白质分子的印迹分析称为eastern印印迹法迹法.所谓的双向电泳是先用等电聚焦所谓的双向电泳是先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（ief-page）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。以电驱动转移方式进行了印迹。 这一方法又被称为这一方法又被称为eastern blotting。 第三节第三节 pcr技术及其应用一一 pcr技术原理技术原理二二 pcr技术应用技术应用本节重点掌握的掌握的内容 掌握掌握rt-pcr

37、、反向、反向pcr、多重、多重pcr、实时荧光、实时荧光定量定量pcr的概念。的概念。 pcr的基本原理的基本原理 pcr引物设计的一般原则引物设计的一般原则 一一 pcr技术原理技术原理（一一） pcr技术简史技术简史（二）（二） pcr的基本原理的基本原理（三）（三） pcr反应反应（四）（四） pcr反应体系反应体系（五）（五） pcr引物的设计一般原则引物的设计一般原则（六）（六） pcr中应注意的事项中应注意的事项pcrpcr技术的概念技术的概念何谓何谓pcr 简单的说，pcr就是利用利用dna聚合酶聚合酶对特定基因做体外或试管内对特定基因做体外或试管内 的大量合成。的大量合成。基本

38、上它是利用dna聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 pcr的要素的要素 被复制的被复制的dna模板模板(template)界定复制范围两端的引物界定复制范围两端的引物(primers).dna聚合酶聚合酶 taq. polymearse 合成的原料及水。合成的原料及水。（一）（一）pcr技术简史技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明 1971年，年，khorana提出：经过提出：经过dna变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用dna聚聚合酶延伸引物，并不断重复该过程合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆便可克隆trna基因。基因。

39、 但由于测序和引物合成的困难，但由于测序和引物合成的困难，khorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了（一）（一）pcr技术简史技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明 1985年，美国年，美国pe-cetus公司的公司的mullis等等人发明了聚合酶链反应（人发明了聚合酶链反应（pcr） 基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的dna复制复制 最初采用最初采用e-coli dna聚合酶聚合酶进行进行pcr，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错力，且易出错pcr的改进与完善的改进与完善mullis最初使用的最初使用的dna聚合

40、酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌 dna 聚合酶聚合酶 i 的的klenow片段，其缺点是：片段，其缺点是： klenow酶不耐高温，酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都会变性失活，每次循环都要重新加。要重新加。 引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其物之间的碱基错配，其pcr产物特异性较差，合成的产物特异性较差，合成的dna片段不均一。片段不均一。1988年年saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种中提取到一种耐热耐热dna聚合酶聚合酶。 此酶

41、具有以下特点：此酶具有以下特点：耐高温耐高温，在，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来的后其残留活性大于原来的90%，在在93下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的60%，在，在95下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长性和扩增效率，增加了扩增长度度2.0kb。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶

42、性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶i klenow片段区别，片段区别，将此酶命名为将此酶命名为taq dna多聚酶多聚酶taq dna polymerase。此酶。此酶的发现使的发现使pcr广泛的被应用。广泛的被应用。 （一）pcr技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明 耐热耐热dna聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得pcr能高效能高效率的进行，随后率的进行，随后pe-cetus公司推出了第公司推出了第一台一台pcr自动化热循环仪自动化热循环仪 1993年，年，mullis等因此项技术获诺贝尔等因此项技术获诺贝尔化学奖化学奖（一）pcr技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明atcgcgatagcg

43、tagctgcgacctagc53tagcgctatcgcatcgacgctggatcg35解旋酶解链酶dnadna解旋解链解旋解链合成引物子链延长（一）pcr技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明atcgcgatagcgtagctgcgacctagc53tagcgctatcgcatcgacgctggatcg35dna解旋解链合成引物合成引物子链延长ggaucg5aucgcg5引物酶引物酶rna引物rna引物（一）pcr技术简史dna的复制聚合酶链反应的发明atcgcgatagcgtagctgcgacctagc53tagcgctatcgcatcgacgctggatcg35dna解旋解链合成引物

44、子链延长子链延长ggaucg5aucgcg5tagcgctatcgcatcgacgct3atagcgtagctgcgaggatcg3dnadna聚合酶聚合酶dnadna聚合酶聚合酶 引物引物引物引物()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20（二）（二） pcr的基本原理的基本原理 类似于类似于dna的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增dna 模板加热模板加热变变性解链性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生使引物与它的靶序列发生退火退火，再将温度升高使退火引物，再将温度升高使退

45、火引物在在dna聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。 这种热变性这种热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个pcr循环，循环，pcr就是在合适条件下的这种就是在合适条件下的这种循环的不断重复。循环的不断重复。denaturation template dna by heat (95oc)target sequencetarget sequence模板模板dna的变性：的变性：模板模板dna经加热至经加热至93左右一定时间后，左右一定时间后，使模板使模板dna双链或经双链或经pcr扩增形成的双链扩增形成的双链dna解离，使之成解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作

46、准备；为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；pcr cycle - step 1 pcr cycle - step 2 temperature is lowered (tm ) and primers anneal to target sequencestarget sequencetarget sequenceprimer 1primer 253553533模板模板dna与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板dna经加热变性成单链后，经加热变性成单链后，温度降至温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；pcr cycle

47、 - step 3 - at 72 o c taq dna polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedtarget sequencetarget sequenceprimer 1primer 253553533taq dnapolymerase引物的延伸：引物的延伸：dna模板模板-引物结引物结合物在合物在taqdna聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dntp为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理

48、，合成一条新的与模板条新的与模板dna 链。链。end of the 1st pcr cycle results in two copies of target sequencetarget sequencetarget sequence每完成一个循每完成一个循环需环需24分钟，分钟， 23小时就能小时就能将待扩目的基将待扩目的基因扩增放大几因扩增放大几百万倍。百万倍。target amplificationno. ofno. amplicon cyclescopies of target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2

49、amplicon2 cycle = 4 amplicon3 cycle = 8 amplicon4 cycle = 16 amplicon5 cycle = 32 amplicon6 cycle = 64 amplicon7 cycle = 128 amplicon第十二讲第十二讲（三）（三）pcr反应反应pcr反应条件pcr过程pcr的特点标准的标准的pcr反应试剂：反应试剂：10x缓冲液缓冲液 10 l4种种dntp混合物混合物 各各200umol/lmg2+ 1.5mmol/l引物引物 各各10100pmol模板模板dna 0.12gtaq dna聚合酶聚合酶 2.5u第十二讲第十二讲p

50、cr仪仪（三）（三）pcr反应反应pcr反应条件pcr过程pcr的特点pcr反应的步骤：反应的步骤：循环前：循环前： 95 90s循环：循环：1.变性变性 94 30-90s 预变时间稍长，使模板充分变质预变时间稍长，使模板充分变质 提高温度会缩短所需时间，但过高温度或过长时间会破坏酶和提高温度会缩短所需时间，但过高温度或过长时间会破坏酶和dntp2.复性复性 50-65 30-90s 变变性结束后，令性结束后，令dna快速冷却，以原模板和引物转录复制。再进行退火快速冷却，以原模板和引物转录复制。再进行退火步骤。复性所需温度决定引物在模板上退火的几率和特异性。步骤。复性所需温度决定引物在模板上

51、退火的几率和特异性。3.延伸延伸 70-75 30s-8min 酶的最适反应温度在酶的最适反应温度在70-75 之间，延伸温度之间，延伸温度一般选在一般选在72 ，延伸时间长短由扩增产物的长，延伸时间长短由扩增产物的长度决定。度决定。4.循环次数循环次数 一般为一般为25-35之间之间循环后：循环后：72 5min；降至降至4冷却冷却1234522557294时间（min）温度（）（三）（三）pcr反应反应pcr反应条件pcr过程pcr的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的dna片段扩增100万倍以上dna双螺旋dna单链与引物复性dna变性形成2条单链子链延伸dna加倍

52、模板dna94pcr的基本原理pcr反应条件pcr过程pcr的特点50-65引物1引物2dna引物pcr的基本原理pcr反应条件pcr过程pcr的特点引物1引物2dna引物72taq酶taq酶pcr的基本原理pcr反应条件pcr过程pcr的特点72第1轮结束第2轮开始pcr的基本原理pcr反应条件pcr过程pcr的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板dna第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n x 平均效率,约为0.85 n 循环次数 （三）（三）pcr反应反应pcr反应条件pcr过程pcr的特点灵敏

53、度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平2.2. 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个病毒个病毒4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组血液、体腔液

54、、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提织等组织的粗提dnadna1. pcr反应成分反应成分（1）模板模板 单、双链单、双链dna均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、dna聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、dna结合结合蛋白类。蛋白类。 一般一般100ng dna模板模板/100 l。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（四）（四）pcr反应体系反应体系（2）引物浓度引物浓度 0.1-0.5 mol/l 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3）taq dna聚合酶聚合酶 0.

55、5-2.5 u/50 l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。（4）dntp dntp浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dntp浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量产量 dntp可与可与mg2+结合，使游离的结合，使游离的mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响dna聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5） mg2+ mg2+是是dna聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂。0.5mmol/l-2.5mmol/l反应体系。反应体系。mg2+浓度过低

56、会使浓度过低会使taq酶活性丧失、酶活性丧失、pcr产量下降；产量下降； mg2+过过高影响反应特异性。高影响反应特异性。mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dntp、edta（乙二（乙二胺四乙酸胺四乙酸 ）等的浓度影响反应中游离的）等的浓度影响反应中游离的mg2+浓度浓度(1) 变性变性 使双链使双链dna解链为单链解链为单链 95oc 20-30秒秒(2) 退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和gc含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可降低温度可增加反应的灵敏性。增加反应的灵敏性。（

57、3）延伸延伸 70-75oc 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数循环次数 主要取决于模版主要取决于模版dna的浓度的浓度 一般为一般为25-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加（五）（五）pcr引物的设计一般原则引物的设计一般原则1.引物长度一般以引物长度一般以1830bp为宜（为宜（一般一般20-23bp），过短则降），过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。同时也增加引物合成的成本。2.避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构，避免序列内，避免序列内有较长的回文结有较长的回文结构构，使引物自身不能形成发夹结构。，使引物自身不能形成发夹结构。3.g/c和和a/t碱基均匀分布，碱基均匀分布， g+c含量含量 在在4060%之间，引之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。啶连续排列。4.要避免两个引物间特别是