DNA和质粒抽提PPT学习教案

1、会计学1DNA和质粒抽提和质粒抽提第1页/共142页第2页/共142页第3页/共142页抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保存2个月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差第4页/共142页mRNAmRNA逆转录后逆转录后RT-PCRRT-PCR结果（结果（0 0、3 3、6 6个月）个月）A B C DA B C D第5页/共142页第6页/共142页第7页/共142页血浆血浆DNADNA内源性循环内源性循环DNADNA外源性循环外源性循环DNADNA自身基因组来源自身基因组来源DNADNA入侵的病毒、细菌

2、等病原体入侵的病毒、细菌等病原体死亡细死亡细胞胞活细胞释活细胞释放放第8页/共142页第9页/共142页第10页/共142页中细胞成分的回收率第11页/共142页样本类型样本类型基因组基因组DNA收率收率20mg肝脏组织肝脏组织8 g100mg豆苗豆苗10 g100 l全血全血2 g2 106培养细胞培养细胞10 g第12页/共142页第13页/共142页细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母第14页

3、/共142页破裂细胞破裂细胞 、释放核酸、释放核酸第15页/共142页第16页/共142页洗涤洗涤第17页/共142页第18页/共142页(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）第19页/共142页 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱第20页/共142页第21页/共142页EB与DNA的结合第22页/共142页500 l全血提取的基因组全血提取的基因组DNA电泳电泳动物组织提取基因组动物组织提取基因组DNA第23页/共142页第24页/共142页第25页/共142页第26页/共142页第27页/共142页第28页/共1

4、42页第29页/共142页第30页/共142页DNA酚抽提法示意图第31页/共142页第32页/共142页第33页/共142页第34页/共142页第35页/共142页第36页/共142页第37页/共142页第38页/共142页第39页/共142页第40页/共142页DNA玻棒缠绕法示意图第41页/共142页第42页/共142页第43页/共142页第44页/共142页第45页/共142页（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段第46页/共142页第47页/共142页第48页/共142页第49页/共142页第50页/共142页第51页/共142页第52页/共142

5、页第53页/共142页第54页/共142页第55页/共142页第56页/共142页第57页/共142页第58页/共142页第59页/共142页第60页/共142页第61页/共142页Chromosome DNA genomePlasmid DNA第62页/共142页第63页/共142页第64页/共142页具有更强的抗切割和抗变性能力具有更强的抗切割和抗变性能力超螺旋超螺旋DNA分子分子 线性线性DNA分子分子 半开环半开环DNA分子分子第65页/共142页Plasmid vectors第66页/共142页Exprssion vector第67页/共142页细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解

6、第68页/共142页第69页/共142页扩增扩增第70页/共142页第71页/共142页第72页/共142页第73页/共142页第74页/共142页问题问题. .第75页/共142页质粒质粒DNA的小量制备的小量制备 2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备 500ml第76页/共142页第77页/共142页（一）碱裂解法（一）碱裂解法(Alkaline )第78页/共142页第79页/共142页第80页/共142页第81页/共142页第82页/共142页碱裂解法示意图第83页/共142页14ml培养细菌收集培养细菌收集细菌破裂溶解细菌破裂溶解染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性染色体基因组

7、和蛋白质变性、质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性Solution ISolution IISolution III分离、纯化质粒分离、纯化质粒DNA第84页/共142页第85页/共142页第86页/共142页第87页/共142页Br染色较弱等第88页/共142页第89页/共142页第90页/共142页第91页/共142页第92页/共142页第93页/共142页2、牙签少量制备法1、 小量一步提取法第94页/共142页第95页/共142页第96页/共142页第97页/共142页第98页/共142页第99页/共142页EBCsCl密

8、度梯度离心法示意图第100页/共142页第101页/共142页第102页/共142页第103页/共142页第104页/共142页第105页/共142页RNA isolation and purificationRNA isolation and purification第106页/共142页第107页/共142页第108页/共142页组织材料起始样品量Total RNA提取量blood1ml1520glecukocytes1107个约100 gLiver tissue1g约5000 gCulture cells1107个约100gRenal tissue1g约3000gSkeleton tis

9、sue1g约1500gCerebral tissue1g约1500g第109页/共142页第110页/共142页第111页/共142页1.内源性内源性RNA酶（酶（intrinsic RNase）第112页/共142页第113页/共142页第114页/共142页第115页/共142页第116页/共142页第117页/共142页OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。第118页/共142页第119页/共142页第120页/共142页第121页/共142页第122页/共142页第123页/共142页第124页/共142页第125页/共142页Trizol第126页/共142页第127页/共142页第128页/共142页第129页/共142页第130页/共142页第131页/共142页第132页/共142页第133页/共142页第134页/共142页静置静置10分钟分钟第135页/共142页RNA浓度（g /ml）=A26040 1/光径稀释倍数RNA纯度=A260/A