miRNA引物设计方法

1、real-time pcr 引物引物设计原则1、引物长度一般为、引物长度一般为1530个核苷酸。个核苷酸。引物过短会使引物过短会使pcr的特异性降低，过长的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过taqdna聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其尤其是引物的是引物的3端不应有连续端不应有连续3个个g和和c。否则会使。否则会使 引物在模板

2、的引物在模板的g+c富集序列区富集序列区错误配对。引物中错误配对。引物中g+c的含量的含量 在在4555%左右。设计引物时要考虑左右。设计引物时要考虑3端和端和5端端 引物具有相似的引物具有相似的tm值。值。tm=4（g+c）+2（a+t）。引物长度要确保解链）。引物长度要确保解链温度不低于温度不低于54c3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免，尤其应避免

3、3端的互补重叠。端的互补重叠。5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物尤其是引物3末端连续末端连续8个碱基个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板dna配对。配对。引物引物3端的端的最佳碱基选择是最佳碱基选择是g和和c。因为它们形成的碱基配对比较稳定。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引物的、引物的5端可以修饰，端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物

4、素，荧光如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在pcr的起始反应中，引物的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链端游离的碱基并不影响引导新生链dna合成的能合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到pcr产物产物的双链中去，所以如此引物参与的的双链中去，所以如此引物参与的pcr产物，既含有目的扩增片段又含有两产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。侧引入的核苷酸序列。引物设计原则成熟序列反义连3端后6-8个碱基做完rt引物的粘附序列部分 acaaccacaaccrt引物的茎环序列5-gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgac-3茎环序列（前）+粘附序列（后）构成mirna的rt primer5-gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacacaacc