第三章发酵工业原料及其处理

1、第三章 发酵工业原料及其处理第一节 培养基的选择和确定第二节 培养工艺的确定方法第一节 培养基的选择和确定一、培养基的营养成分二、培养基的用途三、发酵培养基的选择四、培养基成分的营养与作用五、培养基确定方法六、正交试验在培养基确定中的应用一、培养基的营养成分n培养基：人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料，同时，培养基也为微生物提供除营养外的其它生长所必须的环境条件。n微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。 n所有发酵培养基都必须提供微生物生

2、长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及碳源、氮源、无机元素、生长因子及水水等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源原料的价格和来源。二、培养基的用途 n筛选菌种n保藏菌种n检验杂菌n培养种子n发酵生产（一）培养基的分类1、按培养基组成物质的化学成分n合成培养基n天然培养基。2、按物理性质n固体n液体3、按用途n选择性培养基n鉴别培养基n富集培养基等（1 1）天然培养基）天然培养基n采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。n适合于各类

3、异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。1、按培养基组成物质的化学成分（2 2）合成培养基）合成培养基n是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素。n适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。n但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。（3 3）半合成培养基）半合成培养基n多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。n大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，

4、在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。（1 1）液体培养基）液体培养基：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。n发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。n在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养n微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。2、按物理性质生理代谢菌种筛选种子培养发酵培养 （2 2）固体培养基）固体培养基n分类：斜面试管、平板等n是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。n作用：n固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。n在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种

5、子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成。n增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。n鉴别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。n选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。3、按用途、按用途（二）发酵生产中的培养基类型 n工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：n斜面培养基n种子培养基n发酵培养基1、斜面培养基n作用：供微生物细胞生长繁殖，包括细菌、酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。n这类培养

6、基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。n特点：n富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。n对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。n斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。2、种子培养基（包括摇瓶种子和小罐种子培养基） n培养种子的目的：n扩大培养，增加细胞数量增加细胞数量；n同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。n种子培养基特点：n必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源充足的氮源和生长因子。n种子培

7、养基中各种营养物质的浓度不必太高浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源碳源和氮源。n种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。n发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。3、发酵培养基发酵培养基的设计和注意事项 （1）提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。（2）配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。（3）主成分与其他成分的配比。（4）控制合适的ph：微生物的

8、生长繁殖或产物的合成往往需要定的ph环境，在最适ph值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的ph适合于微生物生长或产物合成所需。n有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。n前体物质n诱导剂n阻遏物n抑制剂n金属离子4、注意代谢调节物的影响：（1）添加有关前体物质： 前体物质：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。（2）添加诱导物：n目前工业用微生物酶多数为诱导

9、酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。n诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。（3）注意阻遏物或抑制剂的影响n培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成，降低发酵产量。n有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量。n在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂，而避免混入有害的抑制物。例：酒精酵母可添加亚硫酸钠固定乙醛，阻止其还原例：酒精酵母可添加亚硫酸钠固定乙醛，阻止其还原成酒精，使代谢往甘油合成的方向发展。成酒精，使代谢往甘油合成的方向发展。n有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。n柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的

10、生产有促进作用；n钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。5、金属离子的影响：三、培养基组成物质的营养与作用n碳素化合物n氮素化合物 n水 n微量元素(无机盐类) n生长因子 1、碳素化合物营养源对微生物生长发育的影响（1）碳素化合物的作用n构成菌体成分的重要元素；n产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料；n化能异养型微生物的能量来源。 n糖：n单糖单糖中的葡萄糖：最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。造成有机酸不能及时氧化，造成培养基ph下降。n寡糖寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖

11、n多糖多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等。其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。n有机酸：柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。（2）碳源种类n醇类：甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。n脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。 n正烷烃：一般是指从石油裂得到的14c至18c的直链烷烃混合物。某一菌种对碳水化合物的利用某一菌种对碳水化合物的利用化合物化合物反应反应化合物化合物反应反应化合物化合物反应反应化合物化合物反应反应化合物化合

12、物反应反应甘 油赤藓糖熊果甙苦杏仁甙l-阿拉伯糖核 糖阿东醇七叶灵纤维二糖d阿拉伯糖醇果 糖半乳糖麦芽糖拢牛儿糖l阿拉伯糖醇肌 醇葡萄糖蜜二糖d岩糖甲基d木糖甙柳 醇甘露糖海藻糖l岩糖甲基d-甘露糖甙乳 糖山梨糖松三糖d松二糖甲基d-葡萄糖甙蔗 糖鼠李糖棉子糖d来苏糖n-乙酰葡糖胺菊 糖卫茅醇木糖醇d塔格糖2酮基葡萄糖酸盐淀 粉甘露醇d-木糖葡萄糖酸盐5酮基葡萄糖酸盐糖 原山梨醇l-木糖d阿拉伯糖对照n糖蜜：糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素化合物、无机盐、维生素等，是微生物工业的价廉物美的原料。n淀粉：淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利

13、用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀。n油和脂肪：油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和co2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。（1）种类的确定：在基础培养基中将碳源换成质量百分比相同的（1-2）的不同碳源，比较对目标产物的影响。（2）目标碳源浓度的确定：选取碳源种类效果好的两种碳源进行不同浓度研究。碳源的确定：2、氮素化合物 n氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。n氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。n就某一类微生物

14、而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别。n有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。n它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。n有机氮源特点：n含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸n还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。n玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。n由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。（1）氮的来源：n无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。n微生物对其吸收利用比有机物快，

15、所以也称速效氮。n利用无机氮时应注意引起的ph变化。n实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮源；n工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。（1）种类的确定：在基础培养基中将氮源换成含氮素百分比相同的（0.1-0.5）的不同氮源，比较对目标产物的影响。（2）目标氮源浓度的确定：选取氮源种类效果好的两种碳源进行不同浓度研究。（2）氮源的确定（1） 水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2） 渗透、分泌、排泄等作用都以水为媒介；（3） 水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4） 水的比热高，能有效地

16、吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5） 水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。3、水 非水相4、微量元素(无机盐类) n无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：构成菌体成分；作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；调节渗透压、ph值、氧化还原电位等；作为自养菌的能源。 n无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类，这是依据微生物对它们需要量的大小划分的。n主要元素有p、s、mg、k、ca等；n微量元素有fe、cu、mn、zn、mo、co、b等。n当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 n一般在复合培养基中由于加入许多

17、动植物原料等都含有微量元素。n磷：n是核酸和蛋白质的必要成分，也是atp的成分。n在代谢途径调节方面，起着重要作用。促进微生物生长，但过量时，许多产物的合成受抑制。n钙：培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。n镁：处于离子状态时，是许多酶的辅酶的激活剂，不但影响基质的氧化，也影响蛋白质的合成。以硫酸镁加入，但在碱性溶液中会形成沉淀。5、生长因子 n广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。其作用是构成细胞的组分，促进生命活动的正常进行。n与微生物有关的维生素主要是b族维生素，这些维

18、生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。n凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少了合成生长素过程中的某种酶)，统称为营养缺陷型。如谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。 四、培养基确定方法（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。n工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时

19、做到心中有数。查资料深入查资料（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验；n然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。n注意培养过程中的ph变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同ph，不断调整配比来适应上述各种情况。摇瓶选择发酵罐（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。n其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。n在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。n最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培

20、养基内ph可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。每次变动一个条件（5） 有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。（6）根据生产和科学研究的需要选择培养基n工业上，液体深层培养具有占地面积小、发酵效率高、操作方便、易于机械化相自动化生产、降低劳动强度等优点。所以，发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行液体发酵，并根据微生物对氧气的要求，分别作表面静止培养或深层通气培养。补料液态固态发酵选择n 实验室或制种车间进行固体培养常采用试管、扁瓶和培养皿。工业生产

21、中也常采用固体原料，如小米、大米、铁皮、马铃署等直接制作斜面，或在茄子瓶表面培养霉菌、放线菌。n具有设备简单、投资少、易推广等优点。n大规模生产中，固体培养的缺点是占地面积多，劳动强度大，生产稳定性差。（7）根据经济效益选择培养基原料n考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。n糖类是主要的碳源。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比考虑生产成本n有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。n代用的原料可以是棉

22、籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，贷源充足，价格低廉，便于就地取材，方便运输。正交试验在培养基确定中的应用n温度 nph值 n氧氧n种龄种龄n接种量接种量n发酵周期发酵周期一、培养条件第二节 培养工艺的确定方法 1、温度 n任何微生物的生长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。n霉菌： 25 -28n担子菌： 25 -28n细菌： 37 n酵母： 28-30 n放线菌： 28 n微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。n通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加

23、快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。 n如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。培养温度对节杆菌z3菌株酶活的影响 2、ph值 n培养基中的ph值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的ph范围。n微生物通过其活动也能改变环境的ph值。n发酵过程中，控制发酵液的ph值是控制生产的指标之一，ph值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。n控制ph值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。培养基初始ph值对arthrobacterz3酶活的影响3、氧 n微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。n不同微生物或同一微生物的不同生长