蛋白质氨基酸

1、第第4 4章章 蛋白质、氨基酸含量的检测蛋白质、氨基酸含量的检测主要内容主要内容 第一节第一节 蛋白质的定量测定方法蛋白质的定量测定方法 第二节第二节 氨基氮含量的检测方法氨基氮含量的检测方法 第三节第三节 多种氨基酸的分离和测定多种氨基酸的分离和测定 第四节第四节 味精纯度的测定方法味精纯度的测定方法第一节第一节 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定一、蛋白质概况一、蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由主要由c、h、o、n、s五种元素组成。某些蛋白五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的质中还含有微量的 p、cu、fe、i 等。等。 样品中

2、蛋白质含量的测定，主要（也是最常用样品中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量。粗蛋白的含量。具体测定方法具体测定方法（一）凯氏定氮法（一）凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍最常用的，国内外应用普遍 （gb/t5009.5gb/t5009.52008 2008 第一法）。第一法）。（二）分光光度法（二）分光光度法（gb/t5009.5gb/t5009.52008 2008 第二法）第二法）（三）电位滴定法（三）电

3、位滴定法（四）双缩脲反应（四）双缩脲反应（五）杜马斯燃烧法（五）杜马斯燃烧法(sn/t2115-2008)(sn/t2115-2008) 进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法杜马斯燃烧法杜马斯燃烧法 二二 、 蛋白质含量的定量测定蛋白质含量的定量测定 一些蛋白质的含氮量一般为一些蛋白质的含氮量一般为 15%-17.6%15%-17.6%， 有的上下浮动有的上下浮动 可以测出总氮可以测出总氮 n n（一）凯氏定氮法（一）凯氏定氮法 丹麦化学家johan kieldahl （克达尔）(1849-1900)研制了今天人所共知的分析有机物中氮含量的凯氏法。于

4、于18831883年提出，年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法及改现发展为常量、微量、自动定氮仪法及改良凯氏法。只介绍前三种。良凯氏法。只介绍前三种。16%n= n= n6.25 = 6.25 = 蛋白质含量蛋白质含量 丹麦分析化学家。丹麦分析化学家。18491849年生于亚格普里斯年生于亚格普里斯,1900,1900年年7 7月月1818日卒于齐斯维勒莱厄。日卒于齐斯维勒莱厄。 18731873年在哥本哈根大学毕业年在哥本哈根大学毕业后后, ,做过农业中学的教师。做过农业中学的教师。18751875年任卡尔斯堡研究所化年任卡尔斯堡研究所化学部负责人学部负责人,1876,1876年任所长年

5、任所长, ,在研究所工作近在研究所工作近2020年。他年。他是丹麦皇家科学院院士是丹麦皇家科学院院士,1884,1884年哥本哈根大学授予他名年哥本哈根大学授予他名誉博士学位。他主要研究发酵化学。誉博士学位。他主要研究发酵化学。18831883年发明测定年发明测定有机化合物中氮含量的方法有机化合物中氮含量的方法: :他将一定质量的试样与硫他将一定质量的试样与硫酸作用酸作用, ,使试样中的氮全部转变为硫酸铵使试样中的氮全部转变为硫酸铵, ,然后往硫酸然后往硫酸铵溶液中加入碱铵溶液中加入碱, ,再将生成的氨蒸馏到一定体积的标准再将生成的氨蒸馏到一定体积的标准酸溶液中酸溶液中, ,再滴定过量的酸再滴

6、定过量的酸, ,就能测出试样的含氮量。就能测出试样的含氮量。此法普遍用于化学和医学研究及农业生产和药物工业。此法普遍用于化学和医学研究及农业生产和药物工业。后人称此法为克氏定氮法。此法所用的仪器是一种梨后人称此法为克氏定氮法。此法所用的仪器是一种梨形长颈烧瓶形长颈烧瓶, ,容量通常约容量通常约300300毫升毫升, ,微量分析用的可以小微量分析用的可以小到到1010毫升毫升, ,后人称这种烧瓶为克氏烧瓶。后人称这种烧瓶为克氏烧瓶。 常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法1. 1. 原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳

7、和水逸出，质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用用h3bo3吸收后再以标准盐酸溶液滴定。根据吸收后再以标准盐酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准h2so4或标准盐酸溶液吸或标准盐酸溶液吸收后再以标准收后再以标准naoh溶液滴定过量的酸。溶液滴定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定、消化消化 总反应式：总反应式：（1

8、1）加硫酸钾）加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。2nh2（ch2）2cooh+13h2so4 （nh4）2so4+6co2+12so2+16h2o一定要用浓硫酸一定要用浓硫酸（98%）（2 2） 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均

9、有毒，价格贵）、硒粉、二加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。氧化钛。（3 3）加氧化剂）加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有如双氧水、次氯酸钾等加速有机机 物氧化速度。物氧化速度。右图为消化装右图为消化装置置、蒸馏蒸馏 消化液消化液 + + 400g/l400g/l氢氧氢氧化钠加热蒸化钠加热蒸馏，放出氨馏，放出氨气。气。、 吸收与滴定吸收与滴定（1 1）用）用20g/lg/l硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲酚绿混合溴甲酚绿混合指示剂）或亚甲基蓝指示剂）或亚甲基蓝甲基红。甲基红。 指示剂指示剂 紫红色

10、紫红色 亮绿色亮绿色 暗灰色暗灰色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸） 2nh3 + 4h3bo3 =（nh4）2b4o7 + 5h2o （nh4）2b4o7 + 2hcl + 5h2o = 2nh4cl + 4h3bo3或（或（2 2）用过量的用过量的 h2so4 或或 hcl 标准溶液吸收，标准溶液吸收，再用再用 naoh 标准溶液滴定过剩的酸液。标准溶液滴定过剩的酸液。吸收吸收 滴定滴定结果计算：结果计算：蛋白质（蛋白质（% %）= 100 注意：注意：f f氮换算为蛋白质的系数，一般为氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.256.25，玉米、高粱为，玉米、高粱为6.246.24，大豆

11、及其制品为，大豆及其制品为5.715.71，大麦为，大麦为5.835.83。 说明：说明： 整个消化过程要在通风橱进行。整个消化过程要在通风橱进行。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 消化时，作空白试验。消化时，作空白试验。fmcvv014.0)(0 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下

12、，并促进其消化完全。化完全。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入冷却，加入30过氧化氢过氧化氢 2-3 ml 后再继续加后再继续加热消化热消化。一般消化至呈透明后，继续消化一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿

13、色。多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸1 1分钟后关掉热源否则可能造成吸收分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。液倒吸。 硼酸吸收液的温度不能超过硼酸吸收液的温度不能超过4040。 混合指示剂在混合指示剂在ph5.2ph5.2时为紫红色，时为紫红色， ph5.4ph5.4时为时为暗灰色，暗灰色， ph5.6ph5.6

14、时为亮绿色，时为亮绿色， 变色点为变色点为ph5.4ph5.4，指示剂变色范围很窄，灵敏度高。指示剂变色范围很窄，灵敏度高。微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量由加入硼酸量由50 ml 10 ml, ,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/l 0.01 mol/l , ,常量法全量蒸馏，微量法少部分蒸馏。常量法全量蒸馏，微量法少部分蒸馏。微量法用微量滴定管滴定。微量法用微量滴定管滴定。3 3、蒸馏装置下图、蒸馏装置下图 。 问题问题：用微量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量：用微量凯氏定氮法测定一

15、样品的蛋白质含量时，测定结果比实际值偏低，试分析其可能的原因？时，测定结果比实际值偏低，试分析其可能的原因？ 应用实例应用实例： 1 1、酱油中全氮含量的测定、酱油中全氮含量的测定 2 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定（、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定（ gb/t 21704-2008） 3 3、麦芽中库尔巴哈值、麦芽中库尔巴哈值; ;蛋白质区分蛋白质区分 （1 1）库尔巴哈值：制麦过程中蛋白质的溶解度，）库尔巴哈值：制麦过程中蛋白质的溶解度，用可溶性氮占总氮的比值表示。用可溶性氮占总氮的比值表示。 （2）啤酒中）啤酒中蛋白质区分蛋白质区分自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围、

16、原理及适用范围: : 同前同前 2 2、特点：、特点：（1 1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。线加热的消化炉。（2 2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8-248-24个样品。个样品。（3 3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，几分钟数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，几分钟完成完成1 1个样。个样。 福斯2300北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司产品名称：产品名称： 凯氏定氮仪凯氏定氮仪 （二）分光光度法（乙酰

17、丙酮比色法）（二）分光光度法（乙酰丙酮比色法） 1 1、原理、原理 （1 1）样品消化）样品消化 硫酸铵。硫酸铵。 （2 2）在）在ph4.8ph4.8的乙酸钠的乙酸钠- -乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-3,5-二乙酰二乙酰-2,6-2,6-二甲基二甲基- -1,4-1,4-二氢化吡啶化合物。二氢化吡啶化合物。 （3 3）在波长）在波长400nm400nm处测定吸光度，与标准系列比较处测定吸光度，与标准系列比较定量。定量。 （4 4）结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。）结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2 2、方法特点

18、、方法特点 （1 1）操作简便）操作简便 （2 2）适合大批量样品蛋白质的测定）适合大批量样品蛋白质的测定（三）电位滴定法（三）电位滴定法 1 1、原理、原理 （1 1）样品消化）样品消化 硫酸铵。硫酸铵。 （2 2）中和样品至）中和样品至ph8.2。 （3 3）4 nh4 + +6hcho (ch2)6n4+2h+ +6h2o （4）2h+ +oh- h2o 2 2、方法特点、方法特点（四）双缩脲法（四）双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法（由

19、农业部于新开发的：双缩脲法（由农业部于2008.10.202008.10.20发布并实施）发布并实施） 适合于乳与乳制品中蛋白质含量的测定。适合于乳与乳制品中蛋白质含量的测定。 1.1.原理原理脲（尿素）脲（尿素）nhnh2 2coconhnh2 2 加热至加热至150150 160160时，两时，两分子缩合成双缩脲。分子缩合成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 coconhnh 与双缩脲结构与双缩脲结构相似。在同样条件下也有

20、呈色反应，在一定条件下，相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（来测其吸光度，确定含量。（540nm540nm）nh2conhconh2 + nh3nh2conh2 + nh2conh22.2.应用应用 乳与乳制品中蛋白质的测定乳与乳制品中蛋白质的测定 双缩脲比色法双缩脲比色法（ny/t 1678-2008ny/t 1678-2008）（五）（五） 杜马斯燃烧法杜马斯燃烧法 1 1、原理、原理 待测样本在纯氧（待测样本在纯氧（99.99%99.99%）环境中高温）环境中高温燃

21、烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成燃烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用tcdtcd检测器检测氮气含量，计算蛋白质含量。检测器检测氮气含量，计算蛋白质含量。 2 2、特点：杜马斯燃烧法不仅能够在、特点：杜马斯燃烧法不仅能够在4 46 6分钟分钟内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测定出凯氏法所不能测定的硝态氮。还能减少对定出凯氏法所不能测定的硝态氮。还能减少对环境的污染以及对人类健康的危害。环境的污染以及对人类健康的危害。 第二节第二节 氨基氮含量的检测方法氨基氮含量

22、的检测方法一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身既有碱性原理：氨基酸本身既有碱性 nhnh2 2，又有，又有 酸性酸性 cooh cooh ，成中性内盐，加入甲醛溶，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与液后，与 nhnh2 2 结合，碱性消失，再用结合，碱性消失，再用强碱来滴定强碱来滴定 cooh cooh 基。基。 2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氨基氮量，特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氨基氮量，其发酵过程中氨基氮量减少情况等（适于游离氨基其发酵过程中氨基氮量减少情况等（适于游离氨基酸的测定）酸的测定） 。3 3、应用实例、应用实例 酿造酱油（酿造酱油（gb18186-

23、2000 gb18186-2000 ）氨基氮含量的测定）氨基氮含量的测定 （1 1）试剂）试剂 a) a) 甲醛溶液：甲醛溶液：37374040； b) 0.05mol/lb) 0.05mol/l氢氧化钠标准滴定溶液氢氧化钠标准滴定溶液 （2 2）分析步骤分析步骤 吸取吸取5.0ml5.0ml样品，置于样品，置于100ml100ml容量瓶中，加水至刻度，容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取混匀后吸取20.0ml20.0ml，置于，置于200ml200ml烧杯中，加水烧杯中，加水60ml60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液c(naoh)=0.05mol

24、/lc(naoh)=0.05mol/l滴定至酸度计指示滴定至酸度计指示phph8.28.2记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/l0.05mol/l）的毫升数，可计算总酸含量的毫升数，可计算总酸含量 。 加入加入10.0ml10.0ml甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液（定溶液（0.05mol/l0.05mol/l）继续滴定至）继续滴定至phph9.2, 9.2, 记下消记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/l0.05mol/l）的毫升数。）的毫升数。 同时取同时取80ml80ml水，

25、先用氢氧化钠溶液（水，先用氢氧化钠溶液（0.05mol/l0.05mol/l）调节调节phph为为8.28.2，再加入，再加入10.0ml10.0ml甲醛溶液，用氢氧化甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液（钠标准滴定溶液（0.05mol/l0.05mol/l）滴定至）滴定至ph=9.2ph=9.2，同，同时做试剂空白试验。时做试剂空白试验。 二、茚三酮比色法二、茚三酮比色法 1 1、 原理：原理：茚三酮与样品中的茚三酮与样品中的-氨基氨基氮反应，得到还原茚三酮，再与氨和未还氮反应，得到还原茚三酮，再与氨和未还原的茚三酮反应，生成蓝紫色络合物，其原的茚三酮反应，生成蓝紫色络合物，其颜色深浅与颜色深浅

26、与-氨基氮含量成正比。在氨基氮含量成正比。在570nm570nm下，测定吸光度，计算样品中的下，测定吸光度，计算样品中的-氨基氮含量。氨基氮含量。 2 2、操作过程、操作过程 （1 1）取）取7 7支试管并编号，于支试管并编号，于0 0号试管中加入蒸号试管中加入蒸馏水馏水2.00 ml2.00 ml，于，于1 1、2 2、3 3号试管中分别加入样号试管中分别加入样液液2.00 ml2.00 ml，4 4、5 5、6 6号试管中分别加入甘氨酸号试管中分别加入甘氨酸标准使用液标准使用液2.00 ml2.00 ml。 （2 2）7 7支试管中各加入发色剂支试管中各加入发色剂1.00 ml1.00 m

27、l，混匀，混匀，盖塞，将试管放入沸水浴中，准确加热盖塞，将试管放入沸水浴中，准确加热16min16min， （3 3）在）在2020水浴中冷却水浴中冷却20min20min。再各加入碘酸。再各加入碘酸钾稀释溶液钾稀释溶液5.00 ml5.00 ml，充分摇匀。，充分摇匀。 （4 4）用空白液管调节仪器零点，于）用空白液管调节仪器零点，于570nm570nm波长波长下，测量吸光度。下，测量吸光度。 3 3、计算、计算 4 4、应用、应用 啤酒生产中：麦汁、麦芽中啤酒生产中：麦汁、麦芽中-氨基氨基氮的测定氮的测定 第三节第三节 多种氨基酸的分离和测定多种氨基酸的分离和测定 一、氨基酸自动分析仪法一、氨基酸自动分析仪法 原理：原理： 1 1、使用阳离子交换树脂（聚苯乙烯、使用阳离子交换树脂（聚苯乙烯经交联再磺化）在色谱柱进行分离；经交联再磺化）在色谱柱进行分离； 2 2、洗脱下来的氨基酸可