如何清洗和保存反相色谱柱

1、如何清洗和保存反相色谱柱？如何清洗和保存反相色谱柱？怎样处理新买来的色谱柱？用水来冲洗色谱柱有什么后果？ 分析结束后如何冲洗？这些问题是 HPLC 分析人员常常面对的。本文就这些问题介绍一些 色谱柱的维护和保养经验。新色谱柱的处理对于新购买的色谱柱， 首先应该做些什么呢？几乎所有的色谱柱在出厂时都保存在它们测试 时的溶剂中，通常是 60-80%的甲醇 /水，这与在反相色谱中使用的流动相是兼容的，所以可 以直接转换到所要使用的流动相。另外， 也可以先用 20-30ml 流动相中的强溶剂甲醇、 乙腈 或者四氢呋喃冲洗色谱柱， 然后再转换到所需流动相。 需注意的是， 在冲洗或平衡色谱柱时， 重要的是

2、溶剂的体积而不是冲洗时间。提高流速可以缩短冲洗平衡时间。如果使用有机溶剂和水或缓冲溶液， 10 倍柱体积的流动相可以使色谱柱达到冲洗平衡。如 果流动相使用离子对试剂，则需 20-50 倍柱体积的流动相。对于直径 4.6mm 的色谱柱，其 柱体积可以按下式估算：Vm=0.1L其中，Vm为柱体积（ml）, L为色谱柱的长度（cm）。故一个15cm x 4.6mm色谱柱大概的 柱体积为1.5ml。直径2.1mm的色谱柱的柱体积大约为4.6mm的20%，所以5cm x 2.1mm的色谱柱含溶剂为 100uL 。对于B型高纯硅胶基质填料的色谱柱，色谱柱的再现性很规范，这与15年前普遍使用的、不是很纯的

3、A 型硅胶基质填料的色谱柱形成鲜明对比, 但很多用来分析产品和原料的 “流传来的 HPLC 方法仍沿用这种色谱柱。有的时候,新的色谱柱需要运行几针分析样品才能但仍需一段时间的例如, 如果你看使保留时间和峰面积保持稳定。 这种情况对于新型的色谱柱比较好一些, 磨合。 有时可以通过运行高浓度的样品或对照品来加速最初的色谱柱平衡。到运行了几针 50ng 的对照品,其保留时间和峰面积有所飘移,试一试运行 1ug 的对照品。这种方法常常可以加速柱平衡的时间。用水冲洗色谱柱我们常常会被问到这样一些问题： “我的样品是水溶性的,流动相中含有缓冲盐和甲醇,我 不能用水来冲洗所有水溶性的污染物吗？”回答是： 不

4、可以”用水冲洗C8或者C18色谱柱有两个缺点,第一,这些色谱柱一般不能与100%水匹配。第二,样品一般总是溶于乙腈和甲醇。用一个不是很恰当的比喻，C18的填料看起来像许多网球，C18链则像一些绒毛附在填料的 表面。这些填料像一些所有表面都在颗粒内部的一块含有 6-15nm 直径小孔的海绵。 C18 链 的表面与固定相键合在小孔的里面, 一小部分裸露在固定小填料的表面, 所以这些小孔是非 常疏水的。在正常的操作中,水 -有机溶剂流动相进入小孔中且完全润湿固定相。分析物的 分子分布于细孔的内外, 并通过与固定相的相互作用被保留在色谱柱上。 当流动相被水替代 后,水分散到小孔中,那么有机相被水稀释了

5、,可是水的极性太大了,以至于不能渗透到键 合相， 不能很好地起到冲洗固定相的作用。 当所有的有机相从小孔中被赶走以后， 相对于键 合固定相，流动相（ 100%水）极性太大了，它会被推出小孔外，这些在非极性颗粒表面凝 结的小水滴就像在停车场里一个油点上的水珠。 这种现象发生的时候， 即使你用一天的时间 冲洗，色谱柱也不会得到清洁。同时，当有机相重新加入时候，则需要更长的柱平衡时间。这种从色谱柱填料细孔中将水排斥出去的过程为 “去湿化 ”。过去我们称之为 “固定相 ”塌陷， 其实固定相没有真的塌陷， 只是它把水从固定相颗粒的细孔中排出在外。 有些色谱柱可以被 100%水冲洗，而不会被 去湿化”。这

6、些色谱柱中嵌入了极性固定相，有时称之为“AC柱或与水匹配的色谱柱，由于色谱柱中含有足够的极性固定相，可以使用100%水。更好的冲洗方法比较好的冲洗色谱柱的方法是首先用水替代流动相中的缓冲溶液，例如，用60：40 的乙腈 -水替代60： 40的乙腈-缓冲溶液，然后冲洗 5-10ml，即可将大多数的缓冲溶液冲洗干净。然 后再转换到 100%有机相，在这种情况下是乙腈。进一步冲洗 10-20 倍柱体积，即可将强保 留污染物从色谱柱上冲洗下来。 色谱柱可以保存在这种有机溶剂中，装在 LC 系统上或取下 来塞上端塞保存都可以。以上冲洗程序适用于所有反相色谱柱，不论是C8、C18，还是苯基、氰基或其它极性

7、键合色谱柱 一开始使用不含缓冲盐的溶剂来冲洗色谱柱或许不是所有方法必需的，但它确是可以采用的一个很好的预防措施，尤其是对于流动相中含有缓冲盐，如磷酸盐。例如，不可以从30：70 的乙腈 -20mM 磷酸盐缓冲盐直接转换到100%乙腈中，因为磷酸盐会在泵或色谱柱中沉淀下来。如果流动相或色谱柱中含有缓冲盐， 不要关闭液相系统超过一个小时以上， 当系统闲置的时 候，如果有机相挥发， 缓冲盐会残留在泵活塞和其它暴露的地方， 进而缩短泵垫底寿命及导 致其他部件过早损坏。 比较好的办法是事先设计一个控制程序在所有样品检测结束后运行洗 柱程序，如前所述先用水替换缓冲液冲洗几分钟，然后用强溶剂冲洗系统。如果L

8、C 系统不具备这种自动转换功能，可以设置一个低流速的方法使泵持续在极低的流速下运行，例如 0.1ml/min ，直到你有时间来冲洗系统。溶解性不好的样品如果样品不溶于流动相中的有机溶剂怎么办， 按照化学合成人员的溶解性测试， 的确有些样 品不能完全溶解在甲醇或者乙腈中， 可是对于分析测试用的样品浓度来说， 样品不太可能不 溶于相同的溶剂中。 如果样品在分析用浓度水平不能溶解的话， 它怎么能在分析过程中从色 谱柱上被洗脱出来呢？对于极少数情况，样品在水-有机溶剂中的临界浓度对其溶解性很重要。但是对于好的液相色谱系统，比较倾向样品溶解在流动相中，并会被流动相洗脱出来。 大多数色谱柱的清洗方法关注的

9、不是样品如何从色谱柱洗脱下来，而是如何将样品所带来的污染物从色谱柱上清洗掉，那么采用强溶剂将是最好的选择。可以采取强溶剂冲洗吗有些色谱工作者喜欢用一些洗脱能力比流动相中强溶剂更强的溶剂来清洗色谱柱，例如， 在用乙腈冲洗色谱柱后，采用二氯甲烷或甲基叔丁基醚或者DMSO 冲洗。的确这样做可以出去一些强吸附在色谱柱上的污染物，但有时要考虑值不值得。我们从经济的角度考虑一下： 对于制药行业来说，一般一个 LC-UV 的分析大约要花费 50 美元。如果一个价值 500 美元 的色谱柱可以持续运行 500 次进样的话，那么每一次进样花费 1 美元，是全部花费的 2%。 如果你用 1 小时来清洗色谱柱，并使

10、其寿命延长一倍的话，你也只是节约全部费用的1%，这是一种很好的投资吗？我觉得如果一根色谱柱可以进样500 次的话， 就已经很值了。 根据经验，即使是血样样品，色谱柱常常能经受 2000 次进样或者更多。色谱柱是消耗品，不是 固定资产，即使它非常贵也仍然是耗材。色谱柱的再次使用如果分析结束后总有一个用流动相中强溶剂冲洗色谱柱的程序，并且色谱柱保存在该溶剂 中，那么下次使用时就比较简单。 色谱柱用强溶剂冲洗过， 所以一些强保留的污染物已经被 冲掉了。下一次使用时，可以直接换到流动相平衡即可，通常使用 10-20 倍柱体积的流动相 足够了。 如果不确定需要多长时间才能平衡色谱柱， 只要用对照品连续

11、2 次进样， 如果连续 两次运行保留时间不变，色谱柱就平衡好了。厂商的忠告没有 “如果上述操作都无济于事， 请参照使用指南 ”这样的忠告， 任何关于色谱柱冲洗的讨论 都是不完全的。 每一根色谱柱出厂时都配有一份使用及维护说明， 如果你没有看到它， 在厂 家的网址中也可以找到，色谱柱使用及维护说明一般包括建议使用的条件、 pH 值限度、禁 用的溶剂以及清洗程序。前面所述的色谱柱清洗程序适用于几乎所有硅胶键合反相液相柱。 手性色谱柱采用 polymeric beads 替代硅胶作为固定相基质的色谱柱。一些正相色谱柱，以 及其它特殊色谱柱， 就使用的溶剂或建议使用的清洗程序来说， 都会有一些限制。 对于这些 情况，请遵守厂商的使用说明。结论如果把流动相冲洗色谱柱并将色谱柱用流动相中100%的强溶剂保存这一清洗程序标准化的话，可以采用上述清洗程序来对新的色谱柱进