第三章第一节酶生物合成的调节

1、chapter 3 the production of enzyme by fermentation of microorganism微生物发酵产酶微生物发酵产酶酶的生产方法提取分离法提取分离法(extraction)(extraction)生物合成法生物合成法(biosynthesis)(biosynthesis)化学合成法化学合成法(chemicalsynthesis)(chemicalsynthesis)sod - bloodpapain-papayachymotrypsin-pancrea organ/tissue/cellamylase from bacillusprotease f

2、rom bacillusphosphatase from bacillusglucoamylase from aspergillusplant cell cultureanimal cell culturefew example酶的生产：指通过各酶的生产：指通过各种方法获得人们所需种方法获得人们所需的酶的技术过程的酶的技术过程一、提取分离法 酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 主要提取方法：主要提取方法： 盐溶液提取盐溶液提取 酸溶液提取酸溶液提取 碱溶液提取碱溶液提取

3、 有机溶剂提取等有机溶剂提取等注意选择适当注意选择适当的溶剂！的溶剂！ 优点：提取方法简单方便优点：提取方法简单方便 缺点：缺点： 必须先获得含酶组织或细胞必须先获得含酶组织或细胞 受气候环境影响受气候环境影响 若培养细胞则工艺路线变复杂若培养细胞则工艺路线变复杂 产品含杂质较多，分离纯化较困难产品含杂质较多，分离纯化较困难适用范围适用范围 在动植物资源丰富的地区在动植物资源丰富的地区 从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中提取碱性磷酸酶提取碱性磷酸酶二、生物合成法（发酵法） 利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获

4、得人们所需酶的技术。生命活动而获得人们所需酶的技术。依细胞依细胞种类不同种类不同微生物微生物发酵产酶发酵产酶植物细胞植物细胞培养产酶培养产酶动物细胞动物细胞培养产酶培养产酶细胞细胞培养培养方式方式不同不同液体液体深层深层培养培养发酵发酵固体固体培养培养发酵发酵固定化固定化细胞细胞发酵发酵固定固定化原化原生质体生质体发酵发酵 酶的发酵生产：经过预先设计，通过酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获人工操作，利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程。得所需的酶的技术过程。1、固体培养发酵 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营

5、养成分，制成固体或半固体其他必要的营养成分，制成固体或半固体的曲麸，经过灭菌、冷却后，接种产酶微的曲麸，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。得所需的酶。 优点：设备简单，操作方便。麸曲中酶的优点：设备简单，操作方便。麸曲中酶的浓度特别高，特别适用于各种霉菌的培养浓度特别高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产物。和发酵产物。 缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。周期长。2、液体深层发酵 将液体培养基置于生物反应器中，经过灭将液体培养基置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细

6、胞，在一定的条菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定的条件下进行发酵，生产得到所需酶。件下进行发酵，生产得到所需酶。 优点：机械化程度较高，技术管理较严格，优点：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。是目前酶发酵生产的主要方式。较高。是目前酶发酵生产的主要方式。 优点：优点： 生产周期短生产周期短 酶的产率较高酶的产率较高 不受资源限制不受资源限制 缺点：对发酵设备和工艺条件要求较高缺点：对发酵设备和工艺条件要求较高三、化学合成法是一种新兴技术是一种新兴技术 局限性局限性单体底物要求纯度高单体底物要求纯度高成本高昂成本高昂只能合

7、成已经清楚化学结构的酶只能合成已经清楚化学结构的酶化学合成法新进展 模拟酶第一节 酶生物合成过程及调节reverse transcription1、中心法则-central dogma replication 复制复制：亲代亲代dna或或rna在一系列酶的作在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代用下，生成与亲代相同的子代dna或或rna的过程。的过程。 transcription 转录转录：以以dna为模板，按照碱基配对为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给原则将其所含的遗传信息传给rna，形成一条与，形成一条与dna链互补的链互补的rna的过程。的过程。 translation 翻

8、译翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mrna为模板，将为模板，将mrna的密码解读成蛋白质的的密码解读成蛋白质的aa顺序的过程。顺序的过程。 reverse translation 逆转录逆转录：以以rna为模板，在逆为模板，在逆转录酶的作用下，生成转录酶的作用下，生成dna的过程。的过程。2、rna的生物合成的生物合成(转录转录)- transcription细胞内rna的生物功能(1) 在某些在某些rna病毒中，其所含的双链病毒中，其所含的双链rna作为遗传信息的载体。作为遗传信息的载体。 (2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种在蛋白质的生物合成过程中，各种rna起着重要的作用。起着重要的作用

9、。trna作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mrna分子分子上的密码子；上的密码子；mrna作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rrna与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。质生物合成的场所。(3) 某些某些rna具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。可以催化有关的生化反应。(4)

10、各种小分子各种小分子rna在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点转录过程的特点1 1、转录的不对称性、转录的不对称性反义链反义链 antisense strandantisense strand（无意义链，负链）（无意义链，负链）有义链有义链 coding strandcoding strand（编码链，正链）（编码链，正链）2 2、转录所需酶、转录所需酶转录过程 起始位点的识别起始位点的识别 recognitionrecognition 转录起始转录起始 initiationinitiation 链的延伸链的延伸 elongationelo

11、ngation 转录终止转录终止 terminationtermination 转录后加工转录后加工 modificationmodificationthe e. coli rna polymerase holoenzyme consists ofsix subunits: possible catalytic subunitspromoterspecificity转录的起始全酶的形成全酶的形成酶与模板结合酶与模板结合酶与启动子结合酶与启动子结合模板模板dna局部变性局部变性转录开始转录开始核心酶与核心酶与因子结合成全酶因子结合成全酶全酶与全酶与dna模板结合生成不稳定复模板结合生成不稳定复合

12、物，沿模板移动寻找到启动子合物，沿模板移动寻找到启动子生成酶与启动子复合物生成酶与启动子复合物dna双螺旋部分解链双螺旋部分解链因子释放因子释放转录延伸因子释放因子释放核心酶移动核心酶移动dna双链解旋双链解旋核糖核苷酸互补核糖核苷酸互补dna双链重新缠绕双链重新缠绕rna链合成的终止 rna聚合酶到达终止密码子，聚合酶到达终止密码子，rna与酶从与酶从dna上脱离，上脱离，rna链合成终止链合成终止rna前体的加工前体的加工剪切反应剪切反应剪接反应剪接反应末端连接反应末端连接反应核苷修饰反应核苷修饰反应3、蛋白质的合成(翻译)-translation翻译翻译: : 以以rnarna中中mrn

13、amrna为模板为模板, ,按照其按照其 核苷酸顺序所组成的密码指核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程导蛋白质的合成的过程. .mrnamrna蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）蛋白质合成的几个要素-mrna(模板，template) mrnamrna是带有是带有dnadna遗传信息指导蛋白质合成的直遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。接模板。 以以mrnamrna为模板为模板, ,合成一定结构的多肽链的过程合成一定结构的多肽链的过程( (翻译翻译) )，就是将，就是将mrnamrna分

14、子中的核苷酸排列顺分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon mrnamrna分子中分子中, ,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为某种氨基酸或其它信息，称为密码子密码子或或三联密码三联密码。 四种核苷酸编成三联体可形成四种核苷酸编成三联体可形成4 43 3个即个即6464个密码子。其个密码子。其中：中： 一个起始密码一个起始密码: : augaug 三个终止密码三个终止密码: : uaa uga uag

15、uaa uga uag 多数氨基酸拥有多数氨基酸拥有 2-42-4个密码个密码蛋白质合成的几个要素- 转运rna (transporter) trnatrna是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。体。 trnatrna有特异性，至少有有特异性，至少有2020种以上。每种种以上。每种trnatrna的反密码环的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的顶端均有由三个核苷酸组成的反密码反密码，能与，能与mrnamrna上相应上相应的密码互补结合。的密码互补结合。酪酪555533augguu uac aca酪氨酰酪氨酰- trna反密码反密码mrna密码

16、密码(codon)(codon)与反密码与反密码(anticodon)(anticodon)的碱基配对的碱基配对蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome 核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rrna组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。the ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶 其他辅助因子其他辅助因子 工具酶工具酶蛋白质的合成过程 肽链合成的起始肽链合成的起始 initiation 肽链合成的延伸肽链合成的延伸 elongation 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放 ter

17、mination and release 合成多肽的输送和加工合成多肽的输送和加工 transport and modification 蛋白质分子的折叠蛋白质分子的折叠 folding氨基酸活化生成氨酰-trna 反应式反应式a.a+trna+atp氨酰氨酰trna合成酶合成酶氨酰氨酰-trna+amp+ppi一般而言，原核生物的第一个氨一般而言，原核生物的第一个氨基酸是甲酰甲硫氨酸，起始基酸是甲酰甲硫氨酸，起始trna是是fmet-trnaf。真核生物的第一个氨基酸是甲硫真核生物的第一个氨基酸是甲硫氨酸，起始氨酸，起始trna是是met-trnamet。蛋白质合成起始30 s亚基亚基+if

18、3 mrna30s-if3-mrna复合物复合物fmet- trnaf+if2+gtpfmet- trnaf-if2-gtpif130s起始复合物起始复合物70s核糖体核糖体if1、if2、if3gdp+pi进进位位转转位位成肽成肽肽链的延伸肽链的延伸合成终止高效率的蛋白质合成体系4、酶生物合成的调节 (regulation)组成酶：组成酶：dna酶，酶，rna酶，糖酵解途酶，糖酵解途径的酶（与生长发育条件无关，径的酶（与生长发育条件无关，常进行定量合成的酶）常进行定量合成的酶）调节酶：适应酶，调节酶：适应酶，-半乳糖苷酶（诱导半乳糖苷酶（诱导酶）酶）酶的类型酶的类型a bex底物水平底物水平

19、的调节的调节酶水平酶水平的调节的调节 酶活性的调节酶活性的调节酶含量的调节酶含量的调节酶的定位调节酶的定位调节辅助因辅助因子调节子调节生长发育的不同时期生长发育的不同时期外界环境变化外界环境变化酶合成酶合成与分解速度的变化与分解速度的变化（基因表达调控）（基因表达调控）产物调节产物调节细胞内酶的调控模式1960年年jacob和和monod提出的操纵子学说提出的操纵子学说调节基因调节基因(r)：产生阻遏蛋白：产生阻遏蛋白启动基因启动基因(p)操纵基因操纵基因(o)：与阻遏蛋白结合：与阻遏蛋白结合结构基因结构基因(s)：蛋白多肽链产物：蛋白多肽链产物操纵操纵子子1.rna聚合酶结合位点聚合酶结合位

20、点2.camp及其受体蛋白复合物及其受体蛋白复合物（camp-crp）结合位点）结合位点（1）操纵子学说）操纵子学说 操纵子学说操纵子学说 莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶（叫做“半乳糖苷酶”），能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖苷酶的基因（简称z）是一个结构基因。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基

21、因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（camp）启动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。由此可知，结构基因同时受两个开关基因操纵基因与启动基因的调控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中同时存在葡萄糖和乳糖时，葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因，并进而抑制结构基因，使细菌不

22、产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。 r p o s1 s2 r p o s1 s2 dna dna调节调节基因基因启动启动基因基因操纵操纵基因基因结构结构基因基因与阻遏蛋白结合与阻遏蛋白结合1.rna聚合酶结合位点聚合酶结合位点2.camp及其受体蛋白复合物及其受体蛋白复合物（camp-crp）结合位点结合位点产生阻遏蛋白产生阻遏蛋白mrnamrna操纵子操纵子 诱导型操纵子诱导型操纵子 无诱导物无诱导物不表达或低表达、不表达或低表达、 有诱导物有诱导物转录成转录成mrna合成酶合成酶 阻遏型操纵子阻遏型操纵子 无诱导物无诱导物正常表达正常

23、表达 有诱导物有诱导物转录受阻转录受阻（2）原核生物中酶生物合成的调节机制a.分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用b.酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用c.酶生物合成的反馈阻遏作用酶生物合成的反馈阻遏作用a.分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳是指容易利用的碳源经过分解代谢产源经过分解代谢产生的物质阻遏某些生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。生物合成的现象。camp camp + h + h2 2o ampo amp磷酸二酯酶磷酸二酯酶 葡萄糖过葡萄糖过量降解量降解atpatpadp, ampadp, ampcamp-crp启动基因上没有启

24、动基因上没有 camp-crp结合结合酶合成酶合成例：葡萄糖阻遏例：葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生半乳糖苷酶的生物合成物合成实质：实质：camp通过启动基因对通过启动基因对酶生物合成进行调节控制。酶生物合成进行调节控制。b.酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用加进某种物质，加进某种物质，使酶的生物合使酶的生物合成开始或加速成开始或加速进行的过程。进行的过程。举例：举例： 乳糖诱导乳糖诱导-半半乳糖苷酶的合成乳糖苷酶的合成 r p o s1 s2 r p o s1 s2 dna dna无诱导物时：无诱导物时：添加诱导物时：添加诱导物时： r p o s1 s2 r p o s1 s2 dna d

25、na诱导物诱导物转录转录翻译翻译mrna酶酶乳糖乳糖 别别乳糖乳糖c.酶生物合成的反馈阻遏作用酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻遏作用）（产物阻遏作用）是指酶催化作用的是指酶催化作用的产物或代谢途径的产物或代谢途径的末端产物使该酶的末端产物使该酶的生物合成受阻的过生物合成受阻的过程。程。举例：无机磷酸阻举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶遏碱性磷酸酶无阻遏物时：无阻遏物时：添加阻遏物时：添加阻遏物时： r p o s1 s2 r p o s1 s2 dna dna翻译翻译mrna r p o s1 s2 r p o s1 s2 dna dna共阻遏物共阻遏物磷酸单酯磷酸单酯 磷酸磷酸+醇醇碱性磷酸酶碱性

26、磷酸酶（3）酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4 4个阶段个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, , 可以把酶生物合可以把酶生物合成的模式分为成的模式分为4 4种类型。即种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型，中期延续合成型，中期合成型合成型和和滞后合成型滞后合成型。 a a、同步合成型、同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞

27、生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，生长速度紧密联系， 又称为又称为生长偶联型。生长偶联型。 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（成单宁酶（tanase ec 3.1.1.20tanase ec 3.1.1.20）。）。 属于同步合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长属于同步合成型的酶

28、，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。细胞细胞浓度浓度mg/ml酶酶浓度浓度u/ml总细胞浓度总细胞浓度 活细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度胞内酶浓度特点：该类酶所对应的特点：该类酶所对应的mrna很不稳定，其寿命一很不稳定，其寿命一般只有几十分钟，细胞进入平衡期后，新的般只有几十分钟，细胞进入平衡期后，新的mrna不再生成，原有的不再生成，原有的mrna被降解，酶生物合成停止。被降解，酶生物合成停止。mrna不稳定

29、，无阻遏作用不稳定，无阻遏作用b b、延续合成型、延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。 属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，ec3.2.1.15）的生物合成。）的生物合成。 细胞细胞浓度浓度

30、mg/ml酶酶浓度浓度u/ml细胞细胞浓度浓度mg/ml酶酶浓度浓度u/ml以半乳糖醛酸为诱导物以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物以含有葡萄糖的果胶为诱导物 特点：这些酶所对应的特点：这些酶所对应的mrna相当稳定，相当稳定，在平衡期后仍在平衡期后仍 可合成相对应的酶可合成相对应的酶mrna稳定，不受阻遏稳定，不受阻遏c.c.中期合成型中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。 例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（例如，枯草杆菌碱性磷酸酶

31、（alkaline phophatasealkaline phophatase，ec 3.1.3.1)ec 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。的生物合成模式属于中期合成型。细胞细胞浓度浓度mg/ml酶酶浓度浓度u/ml特点：酶的生物合成受产物或分解代谢产物特点：酶的生物合成受产物或分解代谢产物阻遏作用，而酶对庆的阻遏作用，而酶对庆的mrna稳定性较差稳定性较差mrna不稳定，受阻遏不稳定，受阻遏d.d.滞后合成型滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为物合成并大量积累。又称为

32、非生长偶联型非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都许多水解酶的生物合成都属于这一类型。属于这一类型。 原因是原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的类型酶所对应的mrnamrna稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉