细胞生物学实验-细胞融合

1、细胞融合实验细胞融合实验一一 定义：定义： cell fusionl细胞融合细胞融合：(cell fusion)又称又称l体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridization）是指将不同来源的原生质体是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞除去细胞壁的细胞)相融合，相融合，将两个或多个细胞合并成将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。一个细胞的技术。人心肌细胞人心肌细胞人肝脏细胞人肝脏细胞种内杂交细胞种内杂交细胞人细胞人细胞鼠细胞鼠细胞种间杂交细胞种间杂交细胞在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂原来

2、两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（交细胞（hybrid cell）。）。种内杂交细胞种内杂交细胞（intraspecific hybrid intraspecific hybrid cellcell）: :同种细胞融合而成的细胞同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞（种间杂交细胞（interspecific hybrid interspecific hybrid cellcell）: : 不同种的细胞融合而成的细胞不同种的细胞融合而成的细胞非对称细胞融合（非对称细胞融合（asymmetric fusionasymmetric fusion）：）：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质

3、失活后再进行融合。 细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：1.1.物理方法，如物理方法，如x x射线、射线、r r射线等，它们能使细胞核失活；射线等，它们能使细胞核失活；2.2.化学方法，核失活碘乙酰胺（化学方法，核失活碘乙酰胺（ioaioa）、碘乙酸）、碘乙酸(iodoacetate)(iodoacetate)；质失活罗丹明（；质失活罗丹明（r r6 6g g，它是一种亲，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。用。动物克隆动物克隆上海第二医科大学上海第二医科大学 陈莹博士陈莹博士

4、2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合, 人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；细胞融合的过程细胞融合的过程细胞互相靠近细胞膜融合细胞桥形成细胞质融合细胞核融合细胞融合分为两种：细胞融合分为两种：1.自发细胞融合2.人工诱导细胞融合（1）自发细胞融合）自发细胞融合 自发细胞融合（自发细胞融合（spontaneous cell spontaneous cell fusionfusion）是在）是在未施加任何诱导条件未施加任何诱导条件的情况下所的情况下所发生的细

5、胞融合现象。发生的细胞融合现象。 自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况：有以下几种情况： 1. 精子和卵子受精精子和卵子受精 2. 肌管的形成肌管的形成 3. 胚胎着床胚胎着床 4. 巨细胞的形成巨细胞的形成 5. 破骨细胞的形成破骨细胞的形成 6. 肿瘤细胞融合肿瘤细胞融合（2）诱导细胞融合）诱导细胞融合人工诱导细胞融合是在人为条件下人为条件下发生的细胞融合现象常用的诱导方法有三种：常用的诱导方法有三种： 1. 生物法（病毒诱导法等）生物法（病毒诱导法等） 2. 化学法（化学法（peg诱导法、诱导法、ca 2+诱导法、诱导

6、法、 溶血卵磷脂诱导法等）溶血卵磷脂诱导法等） 3. 物理法（电诱导法等）物理法（电诱导法等）1.病毒诱导法病毒诱导法常用的病毒：仙台病毒（常用的病毒：仙台病毒（sendal virus),又称日本血凝病毒又称日本血凝病毒n（hemagglutinating virus of japan,hvj）n 属于副粘液病毒科，属于副粘液病毒科，rna病毒，病毒，圆球形圆球形n 19621962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。台病毒可诱导细胞融合。npeg: 聚乙二醇（聚乙二醇（polyethylene glycol, peg）n分子式：分子式：

7、hoch2(ch2och2)nch2ohn性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、沉淀蛋白质的作用沉淀蛋白质的作用n 分子量分子量 1000-6000u，可作诱融剂。，可作诱融剂。20世纪世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合聚乙二醇聚乙二醇普遍认为聚乙二醇分普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂触点处质膜的脂 类分类分子发生疏散和重组，子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲分子层质膜的相互亲和以及

8、彼此的表面张和以及彼此的表面张力作用，力作用， 从而使细胞从而使细胞发生融合发生融合 聚乙二醇（聚乙二醇（pegpeg）介导的细胞融合）介导的细胞融合 原理：原理：pegpeg带有大量的负带有大量的负电荷电荷, ,和原生质体表面的和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，原生质体间的粘着和结合，在高在高ph,ph,高钙离子的溶液高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与的作用下，将钙离子和与质膜结合的质膜结合的pegpeg分子洗脱，分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上分配

9、，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融而形成具有共同质膜的融合体。合体。 融合过程中应注意 事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。 原生质体的密度应在105个ml左右，两种原生质体按1：1等量混合。 常用peg的分子量通常为40006000，加热熔化与eagle溶液配成50(wv)浓度(小分子质量的peg配成55浓度)。加入peg后，24培育1020min 注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入高ph、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。3.1981年，sc

10、heurich和zimmermann发明了电诱导细胞融合。电融合槽电融合槽在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 细胞电融合细胞电融合 原理：原理： 悬于大小不同的两平行电悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的极间的低导电率溶液中的细胞，在细胞，在1 1100mhz100mhz和和1001001000v/cm1000v/cm的交流电的交流电场中，会向小电极移动，场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电并极化成偶极子，而沿电场方向发生场方向发生双向电泳双向电泳，此，此时再

11、加上适当强度和持续时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产使相邻细胞膜的接触区产生生可逆电降解可逆电降解，从而触发，从而触发细胞融合。细胞融合。+-+-+-+-+偶极子偶极子电诱导法原理电诱导法原理+-+双向电泳：在交流电场的作用下（1mhz，150v/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露

12、醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。优点：优点： 融合率高，达7080，甚至100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去peg诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。融合指数融合指数（fusion indexfusion index）: :反映细胞融合的效率反映细胞融合的效率有两种计算方法：有两种计算方法：1.fi=1.fi=（对照组细胞数（对照组细胞数- -试验组细胞数）试验组细胞数）/ /试验组细胞数试验组细胞数2.2.fi=多核细胞中的细胞核数多核细

13、胞中的细胞核数/ /所有细胞所有细胞中的细胞核数中的细胞核数不同细胞融合的条件及其主要应用 来源来源 前处理前处理 融合的方法融合的方法 主要应用主要应用 动物细胞动物细胞 不需不需 仙台病毒仙台病毒, peg ，电融合，电融合 生产单克隆抗体生产单克隆抗体 植物细胞植物细胞 脱壁脱壁 peg,电融合电融合 创造植物新品种创造植物新品种 微生物细胞微生物细胞 脱壁脱壁 peg, 高产优质新菌种高产优质新菌种同核体同核体同核体同核体异核体（杂交细胞）异核体（杂交细胞）未融合未融合未融合未融合加入融合剂加入融合剂融合细胞的类型融合细胞的类型 同核体：同核体：由同一亲本细胞融合而来由同一亲本细胞融合

14、而来 异核体：异核体： （heterokaryon）有不同亲本细有不同亲本细胞融合而来胞融合而来 异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核。胞含有两个不同的细胞核。动物细胞融合影响因素 动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、ph、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。 亲本细胞表面性质影响较大亲本细胞表面性质影响较大 细胞种类不同，融合效果也不同细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。 如仙台病毒诱导-腹水

15、癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34振摇则融合率下降。在37时不振摇则-不融合。 细胞融合过程中，通常耗氧量较大通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。 有些细胞融合时需要有些细胞融合时需要caca2+2+，否则不融合，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。 实验表明sr2+、ba2+、mg2+、mn2+等离子可代替ca2+，但有效浓度较ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/l。 最适合的最适合的phph为为7.4-7.87.4-7.8之间之间，在此范围之外，融合率均较低。温度敏感筛

16、选法温度敏感筛选法细胞融合的应用细胞融合的应用1.用于基因定位用于基因定位2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗2.用于动物育种用于动物育种3.用于细胞治疗用于细胞治疗4.用于生产单克隆抗体用于生产单克隆抗体5.用于研究核质关系和肿瘤发生机制用于研究核质关系和肿瘤发生机制the nobel prize in physiology or medicine 1984for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodiesgeorges j.f. koehler federal repu

17、blic of germany basel institute for immunology basel, switzerland b. 1946 d. 1995 car milstein argentina and united kingdom mrc laboratory of molecular biology cambridge, united kingdom b. 1927(in bahia blanca, argentina)d. 2002 科莱尔米尔斯坦 细胞融合细胞融合杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选可分泌特异性单克隆抗体可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选的杂交瘤细胞的

18、筛选杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养单克隆抗体的生产和纯化单克隆抗体的生产和纯化生生 产产 过过 程程b 淋巴细胞的准备淋巴细胞的准备红细胞将红细胞注入小鼠皮下或腹腔取出脾脏b淋巴细胞骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备 骨髓瘤细胞：是癌变的浆细胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必须选择 不分泌免疫球蛋白的缺陷型 骨髓瘤细胞， 细胞融合细胞融合加入peg作融合剂b淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞1234三三 杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选融 合将细胞转移到hat培养基中培养hat1234四四 可分泌特异性单克隆抗体可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选的杂交瘤细胞的筛选hat将培养皿孔内的

19、上清液取出，检测抗体。常用的方法将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。融 合五五 杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养1 2 3 4 5 6融 合hat1.1.有限稀释法有限稀释法稀释稀释. .n2）软琼脂培养法：）软琼脂培养法： 本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原理是

20、利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生理是利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来琼脂上挑出来(一般一般810天后天后)，再移到液体培养，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。也可以用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀也可以用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀的方法来直接测它的活性。的方法来直接测它的活性。3.3.显微镜操作法显微镜操作法n3）显微镜操作法）显微镜操作法 在倒置在倒置(或解剖或解剖)显微镜下，借助于毛细吸管将显微镜下，借助

21、于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。瑰花结两种方法。普通显微镜操作法：于普通显微镜操作法：于6cm平皿中，假如约平皿中，假如约103个个细胞；细胞；co2培养基箱中静置培养基箱中静置1小时左右无菌条件；小时左右无菌条件；在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞移至预先加有饲养细胞的单个细胞移至预先加有饲养细胞的96孔板内直至孔板内直至96孔均分装有细胞，加盖；于孔均分装有细胞，加盖；于

22、co2培养箱内培养培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法。观察与更换培养方法同有限稀释法。玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在受体，在定的条件下常可与特异性抗原致敏的定的条件下常可与特异性抗原致敏的羊红细胞形成玫瑰花结。如果从免疫动物的脾细羊红细胞形成玫瑰花结。如果从免疫动物的脾细胞中除去能形成特异性玫瑰花结的细胞则失去对胞中除去能形成特异性玫瑰花结的细胞则失去对特异性抗原的反应性。特异性抗原的反应性。4.4.荧光激活分离法荧光激活分离法杂交瘤细胞产生杂交瘤细胞产生 单克隆抗体示意图单克隆抗体示意图这样的人畜细胞融合会造成什么后果？这

23、样的人畜细胞融合会造成什么后果？4位专家分析指出：位专家分析指出：首先，某些目前未知的兔子疾病将传染给人类，就像艾首先，某些目前未知的兔子疾病将传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来。滋病病毒可能是从非洲猩猩而来。尽管中山医科大学把胚胎用于治疗性克隆研究，但万一尽管中山医科大学把胚胎用于治疗性克隆研究，但万一被居心叵测者植人人类子宫，就可能产生一个人兔杂交被居心叵测者植人人类子宫，就可能产生一个人兔杂交种。种。“这完全是对人类尊严的亵读。这完全是对人类尊严的亵读。”精子和卵子受精精子和卵子受精肌管肌管巨巨 细细 胞胞骨巨细胞瘤骨巨细胞瘤 蟾蜍血红细胞蟾蜍血红细胞 鸡血红细胞鸡血红细胞n

24、 实验步骤实验步骤 n1.1.试剂：试剂： n(1)alsver(1)alsver液：葡萄糖液：葡萄糖2.05 g2.05 g，柠檬酸钠，柠檬酸钠 0.8 g0.8 g，氯，氯化钠化钠0.42 g0.42 g，加重蒸水至，加重蒸水至100 ml 100 ml 即可。即可。 n(2)gkn(2)gkn液：氯化钠液：氯化钠8 g8 g，氯化钾，氯化钾0.4 g0.4 g， 磷酸氢二钠磷酸氢二钠1.77g1.77g，磷酸二氢钠，磷酸二氢钠0.69g0.69g，葡萄糖，葡萄糖2 g2 g，酚红，酚红0.01 g0.01 g，溶于溶于1000ml1000ml重蒸水中。重蒸水中。 n(3)ringer(3

25、)ringer溶液：二氯化钠溶液：二氯化钠0.25g0.25g，氯化钾，氯化钾 0.42g0.42g，氯化钠氯化钠6.5g(6.5g(恒温动物恒温动物9g)9g)溶于溶于1000 ml1000 ml蒸馏水中。蒸馏水中。 (4)50(4)50pegpeg混合液：称取少许混合液：称取少许peg(mw 4000)peg(mw 4000)放人刻放人刻度离心管内，在沸水浴中加热，度离心管内，在沸水浴中加热， 的等体积的的等体积的gkngkn液，液，混匀。混匀。 实验步骤 n1.1.细胞悬液的制备：细胞悬液的制备： n(1)(1)蟾蜍血红细胞悬液制备：注射器吸蟾蜍血红细胞悬液制备：注射器吸1mlalsver1mlalsver液后，从蟾蜍主液后，从蟾蜍主动脉弓取血动脉弓取血1ml 1ml ，再加入，再加入2mlalsver2mlalsver液放入刻度离心管内，按照液放入刻度离心管内，按照3 3：1(v1(vv)v)加入加入6ml als