细胞生物学实验：实验八－植物愈伤组织的诱导分化

1、上次实验总结上次实验总结 实验名称实验名称：动物细胞原代培养 实验结果实验结果：全部实验小组都没有染菌，细胞生长旺盛，结果非常理想。原代培养4天的小鼠肝细胞（生长晕）原代培养4天的小鼠肝组织块（10）实验八实验八 植物愈伤组织的诱导和分化植物愈伤组织的诱导和分化 指导教师：何春梅 林建中1 实验目的实验目的 了解培养基的配制过程； 掌握植物外植体的选择和表面消毒方法； 掌握无菌条件下愈伤组织的诱导操作方法； 了解植物组织脱分化过程中的形态变化特点。2 实验原理实验原理 细胞的全能性: 低等生物高等生物；植物细胞动物细胞，幼嫩细胞年老细胞。 植物重要激素：生长素，细胞分裂素。 根据植物细胞的全能

2、性，利用植物激素中的生长素和细胞分裂素等两类重要激素的不同配比，人为控制细胞的分裂和分化方向，实现对植物细胞和组织的脱分化、再分化和生根等。 表达载体农杆菌EHA105电激共转染诱导7d的愈伤组织潮霉素筛选分化生根及basta筛选炼苗移栽大田转化周期为转化周期为30-40天，转化效率为天，转化效率为70-80%，比传统转化方法缩短比传统转化方法缩短1-2个月。个月。组织培养是基因工程的基础组织培养是基因工程的基础粳稻转化过程：粳稻转化过程：烟草的组织培养优势烟草的组织培养优势 烟草烟草香烟香烟。 自1973年基因工程诞生以来，烟草成为典型的基因工程模式植物。由于其蛋白含量高，是理想的生物反应器

3、受体植物。 本实验以烟草叶片为外植体，进行愈伤组织的诱导，掌握基本的植物组织培养实验操作技能。 吸烟有害，种烟致富！烟草愈伤组织烟草愈伤组织魔芋愈伤组织魔芋愈伤组织3 实验材料实验材料,仪器和试剂仪器和试剂3.1 实验材料：实验材料： 自然生长的烟草苗 3.2 实验仪器实验仪器： 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、酒精灯、镊子、脱脂棉、打火机、量筒、移液管、锥形瓶（灭菌）、培养皿（灭菌）、无菌滤纸、封口膜、橡皮筋、分析天平。3.3 实验药品和试剂实验药品和试剂 70%酒精， 20% NaClO， 无菌水， 培养基配制用药品（见附件）4 实验步骤实验步骤4.1 MS培养基的配制 烟草愈伤组

4、织诱导培养基: MS + 6-BA 2 mg/L + NAA 2 mg/L + 蔗糖 30g/L + 琼脂 8 mg/L。各种MS母液和激素母液均按附件中的配方配制。试剂试剂用量（用量（1000 ml）MS无机大量元素无机大量元素（20）50 mlMS无机微量元素无机微量元素（1000）1 mlMS铜钴母液（铜钴母液（2000）0.5 mlMS 有机（有机（200）5 ml铁盐（铁盐（200）5 ml蔗糖蔗糖 30 g水解酪蛋白水解酪蛋白1 g6-BA（0.2 mg/ml）10 mlNAA (0.2 mg/ml)10 ml定容至定容至1 L，调，调pH为为5.8，后在加入，后在加入琼脂琼脂8

5、g表表 MS培养基各成分的添加量培养基各成分的添加量 高压蒸汽灭菌20分钟。 在超净工作台上分装培养基，每瓶约40 ml。培养基的分装培养基的分装4.2 外植体的选择和灭菌外植体的选择和灭菌 选取幼嫩的烟草叶片，撕成较小的碎片。 70%酒精中浸泡1-2min。 20% NaClO中灭菌7-10 min。 无菌水冲洗4-5次。 无菌滤纸上吸干水分，用手术刀将叶片切成1 -2 cm2左右的小块，接种于诱导培养基中。 经过3周的诱导培养后，即可挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养。外植体的选取与表面消毒外植体的选取与表面消毒无菌水的冲洗无菌水的冲洗接种培养接种培养4.4 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 将接种有烟草叶片的诱导培养基放至光照培养箱中培养。 培养条件：26 ，12小时光照/12小时黑暗。 大约2-3天后可以见到烟草叶片增厚卷曲。 5-6天后可以见到叶片边缘膨大开始出现愈伤组织。 大约10天后愈伤组织比较明显。 3周后可以得到很好的胚性愈伤组织。 挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养或其他后续操作，如原生质体的培养和转基因等。5 实验数据的记录和分析实验数据的记录和分析 仔细观察植物细胞和组织脱分化的过程，并拍照保存图片。 统计叶片愈伤组织的诱导率。 诱导率=诱