分子生物学：4-DNA复制

1、 DNADNADNA的的的生物合成生物合成生物合成 第第第4 4 4章章章化学工业出版社化学工业出版社 1953年Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构的那篇划时代的论文中，作者指出，“我们没有忽视从我们提出的特异性碱基配对可以立即提出遗传物质复制的一种可能机制”。几周以后，Watson和Crick提出了DNA复制的半保留机制，并于1958年得到Meselson和Stahl的同位素实验证实。经过几十年的研究，DNA复制的过程，参与复制过程的酶和蛋白质及其作用机制已基本清楚，但有关的一些细节，和DNA复制的调控，有待进一步深入研究。 探索DNA复制的详细机制及其调控，显然是一项非常有吸引

2、了的工作。这一领域的进展，对于我们深入理解遗传物质的传递模式，控制生物体的生长过程，控制肿瘤和艾滋病等严重疾病，均有重要意义。 4.1 DNA复制的概况复制的概况 DNA复制复制(replication)是指亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA分子的过程。不论是原核生物还是真核生物，在细胞增殖周期的一定阶段，DNA将发生精确的复制。随即细胞分裂，并以染色体为单位，将复制好的DNA分配到两个子细胞中。染色体外的遗传物质如质粒和噬菌体，以及线粒体和叶绿体DNA也有基本相似的复制过程，但它们的复制受到染色体DNA复制的控制。 DNA复制过程的研究一般采用三类系统：一是X174 D

3、NA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统。二是以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制。三是以酵母和动物病毒为模式生物，研究真核生物的DNA复制。由于真核生物的复杂性，有关真核生物DNA复制，仍有很多问题有待深入研究。 4.1.1 DNA的半保留复制的半保留复制 Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型后不久，就提出了半保留复制半保留复制(semiconservative replication)的设想，即DNA的两条链彼此分开各自作为模板，按碱基配对规则合成互补链。由此产生的子代DNA的一条链来自亲代，另一条链则是以这条亲代链为模板合成的新链。不过，

4、母体DNA的两条链是如何解开的，在当时是一个难题。因为两条链的解开，需要母体DNA双连部分的旋转，或解开以后的一条单链绕另一条单链旋转，据估算，这种旋转的速度是相当高的。因此有人提出全保留复制的假设，即新合成的两条链构成新的子代分子，亲代分子则保留了原有的两条链，这种设想似乎可以避免解链过程中分子的旋转，一度也得到不少学者的认可。 直到1958年，Meselson和Stahl应用同位素标记法和CsCl密度梯度超速离心技术研究E.coli的 DNA复制，才证实了半保留复制是正确的。 关于两条链解开时，分子需要旋转的问题，在发现多种与此有关的酶和蛋白质以后，也得到了很好的解决。 Taylor 蚕豆

5、根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。4.1.2 复制的起点和方向复制的起点和方向 基因组中能独立进行复制的单位称复制子复制子(replicon) ，在每个细胞周期中，每个复制子只复制一次。原核细胞基因组、质粒、许多噬菌体、某些病毒的DNA及真核生物的细胞器DNA，一般由单个复制子构成。复制时，从一个固定的起点起点(origin)开始复制，此时双链DNA解开形成两条单链，分别作为模板进行复制，由此形成的结构很像叉子，被形象地称作复制叉复制叉(replication fork)。复制的方向大多是双向的，并形成含有两个复制叉的复

6、制泡或复制眼(replication eye)。少数是少数是单向复制的，只形成一个复制叉。 1963年Cairns在大肠杆菌的培养基中加入3H标记的脱氧胸苷，经过适当时间的培养后，用溶菌酶去除细胞壁，分离完整的大肠杆菌DNA，铺到一张透析膜上，在暗处将感光乳胶复盖到经过干燥的透析膜上，避光放置数周后显影，由于3H放射性衰变所放出的粒子使乳胶感光，显影后可形成黑点(银粒子)记录下来。将显影后的胶片致于光学显微镜下，可以看到大肠杆菌DNA的全貌。Cairns用低放射性3H作第一次脉冲标记后，再用高放射性3H作短期标记，然后观察DNA复制所形成的放射自显影图片，结果低放射活性区在复制泡的中间，而高放

7、射活性区则在两端，这说明肠杆菌染色体的复制是朝两个方向进行的(图4-2)。环形DNA复制时，DNA会形成类似字母的形状，故称作型复制。 Addition of 3H for a short period just before the reaction is stopped allows a distinction to be made between unidirectional and bidirectional replication, by determining whether label (red) is found at one or both replication forks

8、 in autoradiograms. This technique has revealed bidirectional replication in E. coli, Bacillus subtilis, and other bacteria. 环形DNA复制时，DNA会形成类似字母的形状，故称作型复制。 Visualization of bidirectional DNA replication. Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta ().

9、(a) Labeling with tritium (3H) shows that both strands are replicated at the same time (new strands shown in red). The electron micrographs illustrate the replication of a circular E. coli plasmid as visualized by autoradiography. DNA复制的起始点是含有100200个碱基对的一段DNA。原核生物的环状DNA只有一个复制起点，其复制叉移动的速度约为105 bp/min

10、。E.coli的DNA复制一次需40min，但在迅速生长的原核生物中，第一次复制尚未完成，第二次复制就在同一个始点上开始，从而，使原核生物可以用更快的速度繁殖。 在真核生物染色体的不同位置上有多个复制起点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有20003000个复制起点。从这些起始点开始向相反方向复制，就形成多个复制泡，这一状况已用电子显微镜观察得到证实。真核生物的复制叉移动较慢(51025103bp /min)，但由于同时起作用的复制叉数目很大，真核生物染色体DNA复制的总速度比原核生物更快。例如，果蝇胚胎的基因组DNA总长为大肠杆菌的40倍，却可在3min内完成复制。 4.2 原核

11、生物原核生物DNA的复制的复制4.2.1 参与原核生物参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质4.2.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA 复制过程中最基本的酶促反应是四种脱氧核苷酸的聚合反应。1956年Arthur Kornberg 等首先从E.coli中分离出催化该反应的DNA聚合酶，即DNA聚合酶聚合酶I(DNA polymerase I, DNA pol I)，1959年Arthur Kornberg因此而荣获诺贝尔生理学或医学奖。DNA pol I 已高度纯化(100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶)，它是Mr为109000的一条肽链，催化DNA新链合成时，需要四种脱氧

12、核苷三磷酸作为底物，还需Mg2+和DNA模板，以及与模板DNA互补的一小段RNA引物，酶的活性部位含有紧密结合的Zn2+。该酶催化新加入的脱氧核苷酸的-磷酸基与引物的3-OH 共价结合，并从新加入的脱氧核苷三磷酸分子上释放焦磷酸，因此合成的方向是从5-末端到3-末端。聚合反应所产生的焦磷酸随即被细胞中的焦磷酸酶分解产生无机磷酸，推动聚合反应的完成(图4-3)。 The search for an enzyme that could synthesize DNA began in 1955. Work by Arthur Kornberg and colleagues led to the pu

13、rification and characterization of DNA polymerase from E. coli cells, a single-polypeptide enzyme now called DNA polymerase I (Mr 103,000; encoded by the polA gene). Much later, investigators found that E. coli contains at least four other distinct DNA polymerases. 脱氧核苷酸单位逐个加到引物的3-端，是按照模板链的碱基顺序，遵循碱基

14、配对的原则进行的。因此DNA聚合酶所催化形成的产物是与模板链碱基顺序互补的DNA链。进一步的研究表明，DNA pol I不但可催化DNA链的延长，也能催化DNA链的水解，它具有35方向的外切酶活力，和53方向的外切酶活力。35外切酶可切除错配的核苷酸，即具有校对功能校对功能(proofreading function)。53外切酶可用于切除RNA引物。 Proofreading refers to any mechanism for correcting errors in protein or nucleic acid synthesis that involves scrutiny of

15、individual units after they have been added to the chain. Bacterial DNA polymerases scrutinize the base pair at the end of the growing chain and excise the nucleotide added in the case of a misfit. 用枯草杆菌蛋白酶对DNA Pol I进行有限的水解，得到两个片段，小片段是由氨基酸残基1323形成的，Mr为 3.4105，含53核酸外切酶活性。大片段是由氨基酸残基324928形成的，Mr为7.6105

16、，按发现者的名字被称作Klenow片段片段(Klenow fragment)，含DNA聚合酶和35核酸外切酶活性。1987年Steitz 对Klenow片段进行X衍射分析，发现其空间结构像一个手掌，由其氨基酸残基324517组成的一个小结构域，含35核酸外切酶活性，由氨基酸残基521928组成拇指(thumb)结构域和掌心(palm)结构域，这两个结构域之间由片层结构连接。拇指和掌心之间形成一个长的裂缝，此裂缝处有线状排列的带正电荷的氨基酸残基，便于同正在复制的DNA结合。其内部还有一个适合于B-DNA 出进的通道(图4-4)。 Crystal structure of phage T7 DN

17、A polymerase has a right hand structure. DNA lies across the palm and is held by the fingers and thumb. DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.亚瑟科恩伯格和罗杰科恩伯格父子，后者因研究真核生物转录的分子机制获2006年诺贝尔化学

18、奖。 Protease cleavage 在DNA复制时，DNA pol I的主要作用是利用其53外切酶活力切除RNA引物，利用其53聚合酶活力，将脱氧核苷酸连接到相邻DNA片段的3-羟基上，逐渐用DNA链取代RNA引物。此外，在DNA损伤的修复中，DNA pol I可用类似的机制切除有损伤的DNA片断，并用正确的DNA片段填补缺口(图4-5)。上述过程可以使DNA链上的切口移动，称切口平移。 1970年代，先后发现了DNA聚合酶聚合酶II (DNA polymeraseII, DNA pol II)和DNA聚合酶聚合酶III(DNA polymeraseIII, DNA pol III)。研

19、究发现，DNA pol I主要参与DNA损伤的修复，DNA pol III是主要的复制酶。E.coli 3种DNA聚合酶的主要数据如表4-1所示，对于多亚基的酶，表中只列出催化亚基的基因。DNA pol II除催化亚基外，还有, , , 和等辅助亚基，表中列出的Mr数据是催化亚基的相对分子质量。 表 4-1 大肠杆菌DNA聚合酶的有关数据DNA聚合酶的类型IIIIII结构基因polApolB(dnaA)polC(dnaE)亚基数 1 710Mr(kD) 10388 830 35外切酶活性有有有53外切酶活性有无无聚合速度(核苷酸/秒)1620402501 000连续合成能力(核苷酸)32001

20、500500 000 DNA pol III含有两个核心酶核心酶(core enzyme)，其亚基组成均为，其中的亚基具有聚合酶活性，亚基具有校对活性， 亚基二聚体将两个核心酶连接为一个复合物。每个核心酶连接一个-滑动夹子滑动夹子(-sliding clamp)结构，每个-滑动夹子由2个亚基构成，可将正在复制的DNA固定在夹子中心，并能随DNA复制沿着模板DNA链滑动(图4-7)。2六个亚基形成夹子装配复夹子装配复合物合物(clamp-loading complex)，促进-滑动夹子同核心酶的装配。-滑动夹子结构使DNA聚合酶不易从模板脱离，有利于DNA的连续复制。需要说明的是，图4-6中未能

21、画出亚基和亚基。 1990年代末发现的DNA聚合酶IV和V在DNA出现严重损伤时，参与DNA损伤的修复。 表4-2 大肠杆菌DNA聚合酶III的亚基组成全酶在DNA上的装配分为三个阶段： （1）一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物前起始复合物。 （2）DNA在于,复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和力，使核心酶能与DNA结合。 （3）二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。DNA polymerase I (coded by polA) is involved in the repair of damaged DNA and, in a subsidiary ro

22、le, in semiconservative replication. DNA polymerase III, a multisubunit protein, is the replicase responsible for de novo synthesis of new strands of DNA. Other enzymes (DNA polymerases II, IV and V) are involved in specific repair reactions.4.1.2.2 参与原核生物参与原核生物DNA复制的其它酶和蛋白质复制的其它酶和蛋白质(1) DNA解旋酶解旋酶 D

23、NA双螺旋的解开需DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase)参与，该酶一般由六个亚基组成，解开双螺旋需ATP提供能量。 E.coli至少编码12种不同的解旋酶，如DnaB蛋白，Rep 蛋白和UvrD蛋白等。 解旋酶与DNA的碱基序列无关，大多数解旋酶优先结合DNA的单链区域，少数解旋酶优先结合DNA的双链区域。解旋酶具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性，可水解被结合的NTP，为DNA解链提供能量。绝大多数解旋酶优先结合ATP，或者只能结合ATP，少数解旋酶优先结合其它的NTP，甚至dNTP。 DNA解旋酶都具有移位酶(translocase)活性，使其能够沿着被结合的DNA链单向移动，以不

24、断地解开DNA双链，解链的速度能达1000 bp/s。解旋酶在与DNA结合以后的移位一般是单向的，被称为解链的极性。根据解链的极性，解旋酶可分为35解旋酶，53解旋酶，和同时向两个方向移位的双极性酶。 解旋酶将NTP水解释放出的化学能，转化成使DNA解链的化学能和机械能，以及解旋酶沿着DNA移位的机械能，所以可将解旋酶视为一种以DNA为运动轨道的，特殊的分子马达。 (2) 单链结合蛋白单链结合蛋白 单链结合蛋白单链结合蛋白(single strand binding protein, SSB) 本身并无任何酶的活性，但通过与DNA单链区段的结合，在DNA复制、修复和重组中发挥以下几个方面的作用

25、： 在解旋酶作用下形成的单链区，存在重新形成双链的电子作用力，SSB同单链区的结合，可维持DNA的单链状态，防止重新形成双链。 SSB同单链区的结合，可防止链内二级结构的形成。 SSB包被在DNA的单链区，可防止核酸酶对单链区的水解。 SSB增强某些酶的活性，如T4噬菌体编码的SSB(gp32)能够增强T4噬菌体DNA聚合酶的活性。 E.coli 的SSB以四聚存在，Mr为74 KD，原核生物的SSB与DNA单链的结合具有正协同效应。其一，先期结合的SSB为后期结合的SSB提供了结合的界面，通过SSB之间的相互作用加快了SSB的结合速度。其二，先期结合的SSB改变了DNA的结构，从而加快了SS

26、B的结合速度。每一个SSB优先结合旁边已结合有SSB的DNA区域，使一长排的SSB结合在单链DNA上，单链DNA模板因此被拉直，有利于随后的DNA合成。 （3） 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase)是一类通过催化DNA链的断裂、旋转和再连接而直接改变DNA拓扑学性质的酶。这一类酶不仅可以清除在染色质重塑(remodeling), DNA复制、重组和转录过程中产生的正超螺旋，而且能够细调细胞内DNA的超螺旋程度，以促进DNA与蛋白质的相互作用，同时防止胞内DNA形成有害的过度超螺旋。 拓扑异构酶I(TopoI)曾被称作蛋白，松驰酶等，是Mr为1.1105的一条

27、肽链，由top基因编码，可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用。其作用机制是切开DNA双链中的一条链，绕另一条链一周后再连接，可以改变DNA的连环数，从而改变超螺旋的圈数，其作用过程不需要ATP提供能量。其反应过程可分作两步，第一次转酯反应由酶活性中心的1个Tyr-OH亲核进攻DNA链上的3, 5-磷酸二酯键，导致DNA链发生断裂，并形成以磷酸酪氨酸酯键相连的酶与DNA的共价中间物。 这种共价中间物既可贮存被断裂的磷酸二酯键中的能量，又可防止DNA链上出现非正常的永久性切口。在断裂的DNA链进行重新连接之前，DNA的另一条链通过切口，导致其拓扑学结构发生变化。最后，在断裂处发生第二次转酯反应

28、，这一次转酯反应由DNA链断裂处的自由OH亲核进攻酶第一次转酯反应形成的磷酸酪氨酸酯键，重新形成3, 5-磷酸二酯键，酶则恢复到原来的状态(图4-8)。 拓扑异构酶拓扑异构酶II(topII)可以切断DNA的两条链，使其跨越另一段双链DNA后再连接，在消耗ATP的情况下，每作用一次可引入2个负超螺旋(见图2-28)。在DNA复制时，引人负超螺旋有利于两条链解开。此外，DNA复制时，随着双链的解开，会产生形成正超螺旋的扭曲张力，TopII引入负超螺旋，可消除这种扭曲张力，使复制可持续进行。 Top I 和 Top II广泛存在于原核和真核生物，Top I主要集中在转录区，与转录有关，Top II

29、分布于染色质骨架蛋白和核基质部分，与复制有关。 （4） 引发酶引发酶 原核生物DNA复制时，首先要在引发酶引发酶(primase)的作用下合成RNA引物，随即在DNA聚合酶III催化下合成DNA链。接着，RNA引物在DNA pol I的53外切酶作用下被切除，并用脱氧核苷酸填补缺口。E.coli的引发酶由dnaG基因编码，在细胞内催化合成约11 nt长的RNA引物。如图4-9所示，E.coli引发酶由一条肽链组成，但具有三个相对独立的结构域，N-端结构域(p12)具有锌指结构，是结合DNA的结构域。C-端结构域(p16)可以与复制叉内的DnaB蛋白相互作用，通过这种相互作用，引发酶被招募到复制

30、叉上。核心结构域(p35)位于中央，是RNA聚合酶的活性中心。 （5） DNA连接酶连接酶 如前所述，DNA pol I可以催化切口平移，但不能催化1个DNA片段的3-OH和另一个DNA片段的5-磷酸基之间最后一个键的形成。在细胞中，切口的连接是由DNA连接酶连接酶(DNA ligase)催化的。噬菌体和真核细胞的DNA连接酶由ATP提供能量，细菌的DNA连接酶由NAD+提供能量。细菌的DNA连接酶只能连接双链DNA一条链上的切口，噬菌体T4的DNA连接酶在一定的条件下，可连接平头双链DNA，这两种DNA连接酶均是基因工程中常用的工具酶。 DNA连接酶催化的反应由三步核苷酸转移反应构成，首先在

31、连接酶的一个Lys残基的-NH2上形成酶-AMP共价中间物，随后AMP被转移到DNA链切口上的5-磷酸基上，最后切口处的3-OH亲核进攻AMP-DNA之间的键，在切口处相邻的核苷酸之间形成3, 5-磷酸二酯键，同时释放出AMP，反应的每一步都需要Mg2+(图4-10)。 酶或蛋白质 Mr（103）亚基数功能结构基因SSB（单链结合蛋白）764稳定解开的单链ssbDna T663预引发n蛋白282预引发引物体装配Dna A504在复制起点特异部位解开双链DNAdna ADna C291传送Dna B至解旋的模板DNA上dna CDna B(解旋酶)3006利用ATP水解能量解开链DNAdna B

32、HU（类组蛋白）192促进起始DnaG(引物酶)601合成RNA引物dna GDNA聚合酶III40010合成DNADNA聚合酶I1091修复（填充缺口）切除RNA引物pol ADNA连接酶741共价连接切口lig拓扑异构酶I1004松弛负超螺旋拓扑异构酶II4004引入负超螺旋A亚基1052链的断裂、再连接gyr AB亚基952ATP酶gry BRep蛋白66135解旋sep解旋酶I180解链解旋酶II751解链解旋酶III20解链表 4-3 参与原核物DNA复制的酶和蛋白质4.2.2 复制的起始复制的起始 E.coli只有一个复制起点称OriC，由245bp组成。这一顺序在大多数细菌中是高

33、度保守的，其排列方式如图4-11所示，关键顺序是3个13bp的正向重复顺序，和4个9bp(TTATCCACA)的重复序列，此外还有11个拷贝的甲基化位点序列GATC。 DNA复制的起始阶段需要在引发体引发体(primosome)作用下合成RNA引物。噬菌体X174的引发体是由Dna B(解旋酶)Dna G(引物酶)和至少6种其它蛋白质构成的复合体，它可以将SSB置换下来，并按53方向合成约1060个核苷酸的RNA引物。 (1) 在HU蛋白、整合宿主因子(integration host factor, IHF)的帮助下，DnaA蛋白四聚体在ATP参与下，结合于OriC的9bp重复顺序(富含A-

34、T)。 (2) DnaA组装成蛋白核心，DNA则环绕其上形成类似核小体的结构。 (3) DnaA蛋白所具有的ATP酶活性，水解ATP以驱动13 bp重复序列内富含AT碱基对的序列解链，形成长约45 bp的开放起始复合物。 (4) 在DnaC蛋白和DnaT蛋白的帮助下，2个DnaB蛋白被招募到解链区，此过程也需要消耗ATP。 (5) 在DnaB蛋白的作用下，OriC内的解链区域不断扩大，形成复制泡和2个复制叉。随着单链区域的扩大，多个SSB结合于解开的DNA单链部分，稳定单链DNA (图4-12)。Dna B解螺旋形成的扭曲张力，在 TOPII的作用下被消除。 4.2.3 DNA链的延伸链的延伸

35、 DNA的两条链是反向平行的，如果两条新链都沿着复制叉解开的方向合成，则一条链需沿53方向合成，另一条链需沿35方向合成。但DNA合成的原料均为5-核苷三磷酸，形成酯键时，只能将5-位的磷酸基连接到引物的3- OH上。与此相对应，迄今发现的DNA聚合酶只能催化53方向的新链合成。如图4-13所示，若新链的合成方向是53，则2, 3-ddNTP可以掺入到新链的末端，并导致合成的终止(图中的a)。若新链的合成方向是35，则2, 3-ddNTP不可能掺入到新链的末端(图中的b)。实验的结果说明，新链的合成方向是53。 DNA复制时，通过何种机制才能使两条模板链均得到复制呢？ 1968年冈崎等用3H标

36、记的脱氧胸苷短时间处理噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着很快即可出现较大的分子。这些DNA短片段被定名为冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)。进一步的研究证明，冈崎片段在细菌和真核细胞中普遍存在。细菌的冈崎片段较长，有10002000个核苷酸。 冈崎的重要发现以及后来许多其他人的研究成果，使人们认识认到DNA复制时，一条链是连续合成的，另一条链是由间断合成的短片段连接而成的，这样的复制过程称作半不连续复制半不连续复制(semidiscontinuous replication)。复制时，DNA的一条链合成方向与复制叉移

37、动的方向一致，沿53方向连续合成，称为前导链前导链(leading strand)。另一条链是在已经形成一段单链区后，先按与复制叉移动的方向相反的方向，沿53方向合成短片段(冈崎片段)，再通过酶的作用将短片段连在一起构成完整的链，称为后随链后随链(lagging strand)。 近年来的研究发现，前导链和后随链的DNA新链是由同一个DNA pol III的两个核心酶分别催化的。如何使后随链合成位点靠近复制叉，且其延伸方向与复制叉的移动方向一到呢？研究发现，后随链的模板链环化，即可使这一问题得到解决(图4-14)。 (3) DnaG沿着DNA模板链合成后随链的RNA引物。 (1) 在PriA,

38、 PriB和PriC蛋白的帮助下，DnaG蛋白(引发酶)被招募到2个复制叉上，与DnaB蛋白结合在一起，DnaA蛋白逐渐脱离复合物。 (2) DnaG沿着DNA模板链合成前导链的RNA引物。 (4) DNA pol III结合到两个复制叉上。 (5) 由DNA pol III分别合成前导链和后随链。 DNA合成的速度是每条链每秒加接约1000个核苷酸。 许多证据表明，上述的复制复合物是与细胞质膜相结合的，DNA复制时，DNA链穿过复合体移动。后随链模板成的环逐渐加大，直至冈畸片段的合成完成，滑动夹连同新合成的冈畸片段脱离核心酶。在这一过程中复制复合物是固定不动的，这一机制有利于整个DNA复制完

39、成后，两个与细胞质膜相结合的子代DNA分子，随细胞分裂被分配在两个子细胞中。 冈崎片段一旦合成完毕，它的RNA引物被DNA pol I除去并用DNA链来替换。留下一个切口(mick)由DNA连接酶连接。 由于DNA复制是半不连续性的，前导链上只需要合成一个RNA引物，而在后随链上则每一个冈崎片段均需要合成一个RNA引物。这些RNA引物随后要被切除，这是一个高度耗能的过程。生物体经过漫长的进化历程，为何会保留这样一种机制？一种可能的解释是，DNA复制时，最初合成的几个核苷酸对还没有形成稳定的双链结构，其碱基堆积力和氢键结合力弱，DNA聚合酶不容易进行35的校对，因此发生错误的几率大。采用RNA引

40、物作为过渡形式，因RNA引物容易被DNA pol 识别，进行切口平移时，切除完RNA引物即可停止切割。用DNA链替代RNA引物时，新引入的脱氧核苷酸被连接到前一个冈崎片段的3-OH上，由于前一个冈崎片段足够长，且DNA pol 具有 35校对功能，所以发生错误的几率很小。 4.2.4 复制的终止复制的终止 单向复制的环状DNA分子，其复制的终点就是其原点。双向复制的DNA环形分子，在两个复制叉相遇时即完成复制。但两个复制叉合成新链的速度一旦出现差异，就可能为复制的终止造成麻烦。研究发现，E.coli的顺时针复制叉有4个连续排列的称作终止子终止子(terminator, ter)的序列。逆时针复

41、制叉有3个连续排列的终止子，当复制叉移动到终止子处，被称作终点利用物质(terminus utilization substans, Tus)的蛋白质会结合在ter序列上，阻止复制叉的移动。这样，当一个复制叉先期到达终止区时，其复制会停止，待另一个复制叉到达同一位置，两个复制叉相遇，即完成了整个DNA的复制过程(图4-17)。 DNA复制完成后两个子代分子以连环体(catenanes)的形式存在，需要由拓扑异构酶IV将其中的一个环状分子切开，使两个子代分子脱离后再将切开的DNA连接成环状分子。 DNA复制完成后两个子代分子以连环体（catenanes）的形式存在，需要由拓扑异构酶将其中的一个环

42、状分子切开，使两个子代分子脱离后再将切开的DNA连接成环状分子。 Replication of the DNA separating the opposing replication forks leaves the completed chromosomes joined as catenanes, or topologically interlinked circles. The circles are not covalently linked, but because they are interwound and each is covalently closed, they can

43、not be separatedexcept by the action of topoisomerases. In E. coli, a type II topoisomerase known as DNA topoisomerase IV plays the primary role in the separation of catenated chromosomes, transiently breaking both DNA strands of one chromosome and allowing the other chromosome to passthrough the br

44、eak.4.3 真核生物真核生物DNA的复制的复制 研究真核生物DNA的复制是一项困难的工作，目前有关的资料主要是从对SV40病毒和酵母菌的研究中得到的。真核生物DNA复制的基本过程与原核生物相似，但参与复制的酶和蛋白质与原核生物不同，复制起始的调控更加复杂。4.3.1 参与真核生物参与真核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质 在真核细胞中发现的DNA聚合酶已超过15种，其中最重要的是较早发现的5种，即DNA聚合酶, , , 和(表4-4)，而新发现的10多种DNA聚合酶，如聚合酶, , , , , , , 和，除外均无3-外切酶活性，也就是说没有校对的功能，它们主要参与DNA损伤的修复

45、。 4.3.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶聚合酶(DNA pol)是一种四聚体蛋白，p180亚基具有类似原核生物DNA pol I的手型结构。其N-端结构域(1329位氨基酸残基)是催化活性和四聚体复合物组装所必需的，中央结构域(3301234位氨基酸残基)参与DNA和 dNTP的结合，及磷酸转移反映，C-端结构域(1 2351 465位氨基酸残基)并非催化活性所必需，但参与和其他亚基的相互作用。 DNA pol的三个小亚基中有两个具有引发酶的活性，负责合成RNA引物。在DNA复制过程中，DNA pol与复制起始区结合，先合成短的RNA引物(长度约为10nt)，再合成20 nt3

46、0 nt的DNA，随后被聚合酶和取代。 DNA pol缺乏3-外切酶活性，因此无校对能力。但在DNA复制过程中，复制蛋白A(replication protein A, RPA)与它相互作用，稳定其与引物末端的结合，同时降低参人错误核苷酸的机会，抵消了无校对能力对复制忠实性的不利影响。 4.3.1.2 DNA聚合酶聚合酶和和 DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由35个亚基组成，如哺乳动物的聚合酶由p125, p66, p50和p12四个亚基组成。DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由四个亚基组成，人DNA pol的四个亚基分别是p261, p59, p17和p12。DNA pol和都有3-外

47、切酶活性，因此具有校对能力。遗传分析表明，若基因突变使聚合酶和的3-外切酶活性降低，可导致生物体突变率的增加。若转基因小鼠的DNA聚合酶丧失3-外切酶的活性，则在12个月内对肿瘤的易感性显著增强。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)为聚合酶的辅助蛋白，其作用相当于E.coli DNA pol III的亚基。在真核细胞DNA复制中，由PCNA三个亚基组成滑动钳，以提高聚合酶合成DNA的连续性 (图4-18) 。冈崎片段合成后，PCNA会从聚合酶及DNA链上脱落，加入另一个冈崎片段合成。 4.3.1.3 DNA聚合酶聚合

48、酶 DNA聚合酶(DNA pol)是真核细胞中最小的DNA聚合酶，由一条Mr为39 kD的多肽链组成。其N-端较小的结构域可与单链DNA结合，且具有5-脱氧核糖磷酸酶(5-deoxyribose phosphatase)的活性，C-端较大的结构域具有聚合酶的活性。DNA pol参与DNA损伤的修复，能够填补DNA链上的短缺口。4.3.1.4 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶(DNA pol)是一种异源二聚体蛋白，位于线粒体基质，负责线粒体DNA的复制和损伤修复。其大亚基具有催化活性，小亚基为辅助亚基，能激活大亚基的催化活性。除了聚合酶活性以外，DNA pol还具有3-外切酶和5-脱氧核糖磷酸酶

49、活性。 *括孤外是SV40病DNA聚合酶的名称，括孤内是酵母相应DNA聚合酶的名称。 表4-4 真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶的类型(I) (IV)(M)(III)(II)相对分子质量(kD)1002204560122亚基数412354聚合酶活性53+外切(校正)酶活性35-+引物(合成)酶活性+-持续合成能力中高高有PCNA时高高对抑制剂敏感蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素细胞定位核核线粒体核核4.3.1.5 其它酶和蛋白质其它酶和蛋白质 真核细胞内的DNA pol都没有5-外切酶活性，因此它们没有切除RNA引物的功能。真核细胞的RNA引物是由核糖核酸酶H1和翼式核酸内切

50、酶-1(flanged endonuclease-1, FEN-1)或FEN1/RNaseHl 切除的，FEN1具有切除RNA引物的核酸外切酶和内切酶活性。此外RFC相当于大肠杆菌的复合物，是一种夹子装置器，帮助PCNA安装到DNA模板上，并与DNA聚合酶结合。SV40 和酵母的DNA复制，起始阶段所需的蛋白质因子的结构和种类差别较大。 E.coli SV40/人 酵母 功能DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶DnaC P ? Cdc6 装配因子DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 Pol的 亚基 Pol Pol,Pol 聚合酶

51、 Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正 Pol的亚基 PCNA(增殖核抗原) PCNA 滑动钳 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白原核和真核生物复制体系的比较4.3.2 真核生物真核生物DNA复制的特点复制的特点 真核细胞DNA的复制主要的共同点有： 均为半保留复制。 均为半不连续复制。 均需要解旋酶解开双螺旋，并由SSB同单链区结合。 均需要拓扑异构酶消除解螺旋形成的扭曲张力。 均需要RNA引物。 新链合成均有校对机制。 主要差别有： 原核生物为单起点复制，真核生物为多起点复制。原核生物的复制子大而少，真核生物的复制子小而多。 原核生物复

52、制叉移动的速度为900 nt/S，真核生物复制叉移动的速度为50 nt/S。 原核生物冈崎片段的大小为10002000nt，真核生物冈崎片段的大小为100200nt。 真核细胞的DNA聚合酶和蛋白质因子的种类比原核细胞多，引发酶活性由DNA pol的两个小亚基承担。 原核细胞在第一轮复制还没有结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制。真核细胞的复制有复制许可因子控制，复制周期不可重叠。 原核生物的DNA为环形分子，DNA复制时不存在末端会缩短的问题。原核生物的DNA为线形分子，DNA复制时末端会缩短，需要端粒酶解决线形DNA的末端复制问题。 多起点、双方向（真核）多起点、双方向（真核）多起

53、点、单方向（真核）多起点、单方向（真核）单起点、单方向（原核）单起点、单方向（原核）单单起点、双方向（原核）起点、双方向（原核）4.3.3 真核生物真核生物DNA复制的过程复制的过程4.3.3.1 SV40DNA的复制的复制 SV40复制起点为64nt，有前期区、中心区和后期区三个功能区。前期区10nt，有不完全回文结构，与其相邻的是T抗原结合位点。中心区23nt，是T抗原结合位点。后期区有17nt的富含AT区，与其相邻的是21bp和72bp区，21bp区富含GC，是转录因子SP1的结合位点。 72bp区是转录和复制的增强子。单独缺失T抗原结合位点或21bp区，复制水平下降30%50%，二者同

54、时缺失，复制水平下降95%。 (1) 2分子由SV40基因组编码的T抗原六聚体 (相当于E.coli的DnaB蛋白)，在ATP的存在下与SV40复制起始区结合，使起始区的DNA解链。 (2) 复制蛋白A (replication protein A, RPA)作为SSB与单链区结合，提高T抗原的解旋酶活性，使解链区扩大，但RPA与单链DNA结合没有协同效应。 (3) DNApol-引发酶复合物与T抗原/RPA复合物结合，合成前导链约10nt的RNA引物，和约30nt的DNA。 (4) 复制因子(replication factor, RFC)先与新合成的DNA3-端结合，随后PCNA取代pol

55、-引发酶结合到DNA模板上，前导链的合成暂时中断。 (5) pol结合到PCNA-RFC复合物上，由于pol具有校对能力，PCNA与模板DNA结合牢固，该复合物可以持续地，准确地合成前导链。同时，pol-引发酶结合到后随链的模版上，开始后随链的合成。后随链的进一步延伸，也需要用PCNA-pol或PCNA-pol取代pol-引发酶(图4-20)。 (6) Fen-1-RNaseHl负责切除RNA引物，DNA连接酶I负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶I负责清除复制叉移动形成的正超螺旋，拓扑异构酶II a和II b则负责解开连环体，促进最后的2个以共价键相连的连环体DNA分开。 4.3.3.2 酵母

56、酵母DNA的复制的复制 酵母DNA复制的起点称自主复制序列自主复制序列(autonomously replicationg sequence，ARS)，其长度约为150bp，有几个对ARS功能所必需的保守顺序，如与原核生物9bp序列相似的序列。酵母染色体IV的着丝粒附近为ARS1序列，分为A, B, C三个功能区, A和B起主要作用，C区次要作用。A区为15bp，其中11 bp的保守区称ARS 一致序列(ARS consensus sequence, ACS)，有复制起始子的功能。B区约为80bp，含B1, B2, B3三个功能区，B3是ARS 结合因子-1(ARS-binding facto

57、r 1, ABF1)的结合区。 酵母DNA复制的起始需要起点识别复合物起点识别复合物(origin recognizing complex, ORC)参与，该复合体由6个亚基组成。相当于原核生物的DnaA。ORC募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂周期基因6(cell division cycle gene 6, cdc6)表达的蛋白质Cdc6，另一种是Cdc10 依赖性转录因子1(Cdc 10-dependent transcript 1, Cdt1)，随后募集微染色体维持蛋白2-7(minichromosome maintenance protein 2-7, Mcm2-7)复合体。Mc

58、m2-7由6个亚基组成，具有解旋酶活性，功能相当于原核生物的DnaB，至此形成的复合物称前复制复合体(Pre-RC)。 Pre-RC需要依赖于周期素的蛋白激酶(cyclin-depending protein kinase,Cdk)激活才能开始DNA的复制，Cdk和另一种蛋白激酶Ddk可以使pri-RC中的Cdc6和Cdt1磷酸化而失去活性，并脱离pre-RC，DNA聚合酶或在一些辅助蛋白的协助下被募集到pre-RC上，接着募集pol-引发酶，合成RNA引物和一小段DNA。随后Mcm2-7复合物也被磷酸化，pol-引发酶脱离复合物，pre-RC募集PCNA-RFC，使pol或DNApol能够连

59、续的合成DNA链(图4-22)。值得注意的是DNA聚合酶或与pre-RC的结合先于pol-引发酶，这可以确保在合成RNA引物前，合成前导链和后随链的酶已经到位。Cdk可以激活pre-RC，同时抑制形成新的pre-RC复合物。这可确保DNA在一个细胞周期只合成一次。在细胞完成分裂后，Cdk即被分解。当细胞因周期素(cyclin)和其它信号传导分子含量的变化使细胞进入S期时，Cdk的活性水平增高，再一次激活DNA的复制，细胞随即进入另一个M期。 当DNA聚合酶接近下游冈崎片段的RNA引物时，RNase H1降解RNA引物到最后一个核苷酸，最后一个核苷酸由FEN1/RTH1切除，连接酶连接两个冈崎片

60、段断。4.3.3 端粒端粒DNA的复制的复制 真核生物的线性DNA复制时，后随链最后一个冈崎片段的RNA引物被切除后，由于其缺口的另一侧不存在核苷酸片段的3-OH，缺口无法用DNA聚合酶填补。随后，模板链的单链部分被水解，因此，随着DNA的复制，染色体的长度会缩短(图4-23)。好在染色体的末端具有端粒端粒(telomere)结构，其中的一条链是由重复序列TTTTGGGG组成的，称TG链。另一条链是由重复序列AAAACCCC组成的，称AC链。这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构。但若端粒缩短到一定程度，细胞会停止分裂。 分裂旺盛的细胞存在端粒酶端粒酶(telomerase)，这种酶是蛋白