生物化学核酸生物化学

1、第二章核酸的化学l认识核酸在生命科学上的重要性认识核酸在生命科学上的重要性l弄清碱基、核苷、核苷酸和核酸分子结弄清碱基、核苷、核苷酸和核酸分子结构上的关系构上的关系l掌握核酸的化学本质及掌握核酸的化学本质及dnadna和和rnarna在组分、在组分、结构和功能上的差异结构和功能上的差异l认识核酸的结构与其性质与功能之间的认识核酸的结构与其性质与功能之间的关系。关系。学习要求学习要求l1869年 f.miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸l1944年 o.n.avery通过转化实验证实dna是主要的遗传物质l1953年 j. d.watson和f.h.c.crick提

2、出dna双螺旋结构模型 l1958年 crick提出遗传信息传递的中心法则l1970年,建立dna重组技术l1980年后,分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成hgp.核酸化学的发展过程一、 核酸(nucleic acid)是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成。 种类： dna （脱氧核糖核酸） rna（核糖核酸） “四核苷酸假说四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性的单体构成的，缺乏结构方面的多样性, ,不不大可能有重要的生理功能。大可能有重要的生理功能。l19441944年，年，avery

3、avery等人的肺炎双球菌转化实验等人的肺炎双球菌转化实验证实核酸是生命遗传的基础物质。证实核酸是生命遗传的基础物质。 l19521952年，年，hersheyhershey和和chasechase的的t2t2噬菌体侵染实噬菌体侵染实验彻底证明遗传物质是核酸，而不是蛋白质。验彻底证明遗传物质是核酸，而不是蛋白质。1928年，英国 s型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑r型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙n 著名的肺炎球菌实验 l结果说明：加热杀死的s型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的r型肺炎球菌转化为有害的s型肺炎球菌l这种生物分子或遗传物质是什么呢？n 著名的肺炎球菌实

4、验 从加热杀死的s型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的r型肺炎球菌中，结果发现，惟独只有核酸可以使无害的r型肺炎球菌转化为有害的s型肺炎球菌。1944年 结论：dna是生命的遗传物质侵染侵染dnadna注射注射进细胞进细胞蛋白质外壳蛋白质外壳 dna噬菌体噬菌体大肠杆菌大肠杆菌分布： dna：主要在细胞核中，是染色体的主 要成分。此外在线粒体、叶绿体. rna：主要在细胞质中，此外在线粒体、细胞核核仁；核酸的组成成分 核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide), 其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。戊糖 碱基磷酸 核苷核苷酸核酸 核苷酸的基本

5、结构ld-d-核糖核糖（d-ribosed-ribose）ld-d-脱氧核糖脱氧核糖 （d-deoxyribosed-deoxyribose）l核酸据此分类：核酸据此分类： 脱氧核糖脱氧核糖dnadna； 核糖核糖rnarna；l核酸中的戊糖均为核酸中的戊糖均为 -d-d-型型从两类核酸的水解产物可看到它们组成的差别?（二）碱基尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶l核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：1 1、嘧啶碱、嘧啶碱(pyrimidine)(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。是嘧啶的衍生物。nnhhhh嘧啶123456nnhhhhnh2oh胞嘧啶 cytosine（c）nn

6、hhhhoohh尿嘧啶 uracil（u）nnhhhhoohhch3胸腺嘧啶 thymine（t）2、嘌呤碱(purine)：由嘌呤衍生而来。nnnnhhhhnnnnhhhh123 456789嘌呤nh2腺嘌呤 adenine（a）nnnnhhhhoh2n鸟嘌呤 guanine（g）3、稀有碱基 一些修饰碱基，因含量甚少而称之。一些修饰碱基，因含量甚少而称之。 大多为大多为甲基化碱基甲基化碱基，多在，多在trnatrna中。中。 （三）核苷： 核苷：核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。 糖苷键糖苷键： 二者的连接是c-n键，称n-糖苷键。ohoh2cohohoh12345核 糖nnnn

7、hhhh9腺嘌呤腺 苷ohoh2cohohoh12345核 糖ohoh2cohoh12345核 糖nnoohhh尿嘧啶h1尿苷ncoonhhh51oh假尿苷（）核苷的表示：核苷：a、g、 c 、u脱氧核苷：da,dg,dc,dt修饰核苷：如5-甲基脱氧胞嘧啶：m5dc。脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比 rna dna组成组成戊糖戊糖 核糖核糖 脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基 a,g,ca,g,c u t磷酸磷酸 pi(磷酸二酯键磷酸二酯键)pi(磷酸二酯键磷酸二酯键)结构结构单链，部分碱基互补，局部双单链，部分碱基互补，局部双螺旋，三叶草形等螺旋，三叶草形等双链，碱基互补，双螺旋双链，碱基互补，双螺

8、旋形形分布分布细胞核细胞核(核仁核仁)， 细胞质细胞质(线粒体、线粒体、核蛋白体、胞液核蛋白体、胞液)细胞核细胞核(染色质染色质) 细胞质细胞质(线粒体线粒体)生物功能生物功能遗传信息表达，反转录，直接遗传信息表达，反转录，直接参与蛋白质的生物合成参与蛋白质的生物合成遗传的物质基础，负责遗遗传的物质基础，负责遗传信息贮存，发布，转录传信息贮存，发布，转录（四）核苷酸1 1、种类：、种类：1 1）按酯化位点：）按酯化位点：可可在核糖的在核糖的2- , 2- , 3-, 5-3-, 5-；2 2）按核糖类型：）按核糖类型： 核苷酸、核苷酸、 脱氧核苷酸脱氧核苷酸核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化，即为核苷

9、酸。2、结构：l与一个磷酸结合与一个磷酸结合mpmp：(d)amp(d)amp、(d)gmp(d)gmp、(d)cmp(d)cmp、(d)tmp(d)tmp、umpumpl与二个磷酸结合与二个磷酸结合dpdp：如：如：adpadpl与三个磷酸结合与三个磷酸结合tptp： 如：如：atpatp ：环核苷酸：环核苷酸：核糖核糖3-, 5- 3-, 5- 成环。成环。 campcamp、 cgmpcgmp功能：功能： 第二信使，激素、第二信使，激素、一些药物、神经递一些药物、神经递质通过其发挥生理质通过其发挥生理作用。作用。环化磷酸化环化磷酸化 campcgmpl5- imp 5- imp 5- 5

10、- 肌苷酸肌苷酸 (5- (5- 次黄嘌呤核苷酸次黄嘌呤核苷酸) )l5- gmp5- gmp1 1、 3-, 53-, 5磷酸二酯磷酸二酯键键将核苷酸连接成核将核苷酸连接成核酸大分子。酸大分子。 多核苷酸链多核苷酸链中各核苷酸中各核苷酸残基的排列残基的排列顺序。顺序。oho-o och2 to=po-35ohoho-o och2 go=po-35oho och2ohoh ao=poo-35351pppohatgpgptpaohpg-t-apgta2）读向： 碱基序列碱基序列从左到右表示从左到右表示5 5 33，由由3-, 53-, 5磷酸二酯键连接。磷酸二酯键连接。 若两链反向平行，则需注明

11、每条链的若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如：走向。如： 5a-t-g-c-c-t-g-a 3 3 t-a-c-g-g-a-c-t 5（一）（一）dna dna 的一的一级结构：级结构： 由数量庞大的由数量庞大的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸通过通过3-, 53-, 5磷酸二酯键磷酸二酯键连连接成的直线形接成的直线形或环形多聚体。或环形多聚体。1 1、双螺旋结构模型建、双螺旋结构模型建立的依据：立的依据：1 1） chargaffchargaff对对dnadna碱碱基组成的定量分析基组成的定量分析, ,提出碱基配对原则：提出碱基配对原则：a=ta=t， gcgc2 2）根据对）根据对dna

12、dna纤维和晶纤维和晶体的体的x-x-衍射分析。衍射分析。3 3）电位滴定证明。）电位滴定证明。 a=ta=t， gc gc 双螺旋中的碱双螺旋中的碱基对基对2.双螺旋结构的特点:(watson-crick模型）1 1）形成：）形成： 两条链反向平行；两条链反向平行； dnadna一条链为另一条链一条链为另一条链互补链互补链 右手螺旋。右手螺旋。 2）结构： a a、核糖核糖- -磷酸以磷酸以3-, 53-, 5磷酸磷酸二酯键连接成骨二酯键连接成骨架；架； 碱基在内；碱基在内； a=ta=t， gcgc b b、大沟、小沟。大沟、小沟。a a、直径：、直径：2nm 2nm ； b b、碱基距离

13、：、碱基距离：0.34nm0.34nm；c c、一周、一周1010个核苷酸；个核苷酸； d d、螺距：、螺距：3.4nm 3.4nm 。b-dnaa-dnaz-dnab-dna与与a-dnab-dnab-dna：生理状态下多为此种；生理状态下多为此种；92%92%相对湿度相对湿度a-dna：右手螺旋；右手螺旋；75%75%相对湿度；生理状态相对湿度；生理状态 下多见下多见dsrnadsrna、dna-rnadna-rnaz-dna：人工合成、人工合成、左手螺旋左手螺旋；嘧啶、嘌呤交；嘧啶、嘌呤交 替；有替；有m m5 5dcdc ；与基因表达调控有关；与基因表达调控有关；此外，还发现有此外，还

14、发现有c c、d d、e e等型。等型。dnadna双螺旋进一步扭曲即成双螺旋进一步扭曲即成三级结构。三级结构。 天然天然dnadna有有双链双链dnadna（dsdnadsdna），）， 有的病毒为有的病毒为单链单链dnadna（ssdnassdna） 在在dsdnadsdna中：中： 线形分子线形分子（大多数）（大多数） 环状分子环状分子（dcdnadcdna）：质粒、）：质粒、 特点特点：l可将长链压缩可将长链压缩在一较小体内；在一较小体内；l密度大；密度大；l凝胶电泳中移凝胶电泳中移动速度快。动速度快。l回文结构中的单链可形成发夹结构特殊dna的结构上页 下页 章首 节首l双链回文结构

15、可形成十字架结构特殊dna的结构上页 下页 章首 节首dna的其他结构ldna三股螺旋概念是在1957年提出来的，当时有人发现，人工合成的一条右手螺旋多聚物(a)n与另两条右手螺旋多聚物(t)n形成三股螺旋结构，这是分子间的三股螺旋。此后有人研究证明，聚da链首先与一条聚dt链互补形成双螺旋，然后，在高盐条件下， 另一条dt链再同双螺旋形成三股螺旋结构。 双螺旋结构通过watson-crick氢键稳定而三股螺旋是通过 hoogsteen氢键稳定。 dna的三股螺旋结构l在真核细胞染色质中，在真核细胞染色质中，dnadna双螺旋分子盘绕双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成在组蛋白上形成核小体。核小体。l

16、许多核小体由许多核小体由dnadna连成念珠状结构，再盘连成念珠状结构，再盘绕压缩成高层次的结构绕压缩成高层次的结构 染色体染色体。 核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的dna分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。1、dna是遗传信息的载体半保留复制半保留复制保证了亲代保证了亲代性状传到子性状传到子代，保证了代，保证了亲代与子代亲代与子代的相似性。的相似性。2、dna是变异的物质基础变异是生物进化的基础。变异的发生：变异是生物进化的基础。变异的发生：1 1）dnadna复制时出错；复制时出错；2 2）理化因素等引起碱基变化或缺失，使）理化因素等引起碱基变化或缺失，使dnadna碱基

17、序列改变，从而发生性状变异。碱基序列改变，从而发生性状变异。四、rna（一）一）rnarna的结构的结构组成组成：4 4种核苷酸，有稀有碱基；种核苷酸，有稀有碱基；连接连接：同：同dnadna形成形成：一般以：一般以dnadna为模板合成，有例外。为模板合成，有例外。结构结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。：单链线形分子，局部区域有双螺旋。三种：三种： 信使信使rnarna（messenger rna,messenger rna,mrnamrna) ) 核糖体核糖体rnarna (ribosomel rna, (ribosomel rna,rrnarrna) ) 转运转运rnarna (tr

18、ansfer rna, (transfer rna,trnatrna) )rnalmrnamrna是遗传信息的携带者。在细胞核中是遗传信息的携带者。在细胞核中转录转录dnadna上的遗传信息，再进入细胞质，上的遗传信息，再进入细胞质，蛋白质合成的模板。蛋白质合成的模板。ltrnatrna起识别密码子和携带相应氨基酸的起识别密码子和携带相应氨基酸的作用。作用。lrrnarrna和蛋白质共同组成的复合体就是核和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。1、trna约占全部约占全部rnarna的的15%15%；由；由70-9070-90个核个核苷酸组

19、成许多种类；苷酸组成许多种类；沉降系数沉降系数4s4s。rna1）trna结构：一级结构一级结构多已清楚，多已清楚，含较多稀有碱基；含较多稀有碱基；二级结构二级结构为三叶草为三叶草 有：有：aaaa臂、臂、 二氢嘧啶环、二氢嘧啶环、 反密码环、反密码环、 可变环、可变环、 t t 环环rna主要特征主要特征：1.1.四臂四环；四臂四环；2.2.氨基酸臂氨基酸臂33端有端有ccaccaohoh的共有结构；的共有结构；3.d3.d环上有二氢尿嘧啶环上有二氢尿嘧啶（d d）；）；4.4.反密码环上的反密反密码环上的反密码子与码子与mrnamrna相互作用；相互作用；5.5.可变环上的核苷酸可变环上的

20、核苷酸数目可以变动；数目可以变动；6.t6.tc c环含有环含有t t和和；7.7.含有修饰碱基和不含有修饰碱基和不变核苷酸。变核苷酸。a、在pr合成中转运aa；b、在pr合成的起始、dna反转录合成及其它代谢调节中起作用。2、mrna1）合成合成： 以以dnadna为模板为模板( (核内核内) ) 合成合成 hnrna（含内含子和外显子）（含内含子和外显子） 加工加工 成熟的成熟的mrnamrna 入细胞质入细胞质 蛋白质合成蛋白质合成rna合成mrna切除内含子33末端有末端有polyapolya结构结构：与：与mrnamrna从核入质有从核入质有关。关。 55末端有帽子结构末端有帽子结构

21、：g g被甲基化，此可能被甲基化，此可能与与propro合成的起始有关。合成的起始有关。 3) 3) 功能：功能：是蛋白质合成的模板是蛋白质合成的模板3、rrna1)占rna总量的80%，是构成核糖体的骨架。2)核糖体功能： prpr合成的部位合成的部位. .3）结构：分大、小亚基 一、二级结构多已确定，但功能不清。rnal原核细胞：70s核糖体；l真核细胞：80s核糖体；核糖体rna自我剪切19831983年在四年在四膜虫中发现膜虫中发现rnarna有催化有催化功能功能1 1）在）在dnadna复制、转录、翻译中起重要调控复制、转录、翻译中起重要调控 作用；作用；2 2）有催化作用；）有催化

22、作用；3 3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。rna一般的理化性质一般的理化性质l为两性电解质，通常表现为酸性。为两性电解质，通常表现为酸性。ldnadna为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，rnarna为白色粉末，微溶为白色粉末，微溶于水，不溶于一般的有机溶剂。于水，不溶于一般的有机溶剂。ldnadna溶液的粘度极高，而溶液的粘度极高，而rnarna溶液要小得多。溶液要小得多。l核酸在离心力的作用下，可以从溶液中沉降下核酸在离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。ldnadna和和rnar

23、na都微溶于水，不溶于乙醇、氯都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。仿等有机溶剂。ldnpdnp溶于高浓度盐溶液中，而溶于高浓度盐溶液中，而rnprnp溶于低溶于低浓度盐溶液。，利用这一性质可分离浓度盐溶液。，利用这一性质可分离dnadna和和rnarna。 0.140.14摩尔法摩尔法: :分离分离dnadna蛋白蛋白(dnp)(dnp)和和rna(rnp)rna(rnp)蛋蛋白白(rnp)(rnp)的方法的方法dna蛋白:在0.14mol/l的nacl溶液中溶解度最低.rna蛋白:在0.14mol/l的nacl溶液中溶解度较大.水解性：水解性：可被酸、碱或酶水解，可被酸、碱或酶水解，dn

24、adna比比rnarna对对稀碱稳定。稀碱稳定。l核酸分子中的磷酸二酯键可在酸、碱性和核酸分子中的磷酸二酯键可在酸、碱性和酶酶条件下水解切断条件下水解切断, ,结果是多核苷酸链被打断结果是多核苷酸链被打断, ,核酸被降解核酸被降解. . 酸解酸解 酸可以使酸可以使dnadna和和rnarna降解，酸对核酸的作用因降解，酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间的不同而不同。酸的浓度、温度和作用时间的不同而不同。 dnadna和和rnarna对碱的耐受程度有很大差别。对碱的耐受程度有很大差别。例如，在例如，在0.1 mol/l naoh0.1 mol/l naoh溶液中，溶液中，rnarna几乎可

25、以完全水解，生成几乎可以完全水解，生成2-2-或或3-3-磷酸核苷；磷酸核苷；dnadna在同样条件下则不受影在同样条件下则不受影响。响。这种水解性能上的差别，与这种水解性能上的差别，与rnarna核核糖基上糖基上2-oh2-oh的参与作用有很大的关的参与作用有很大的关系。在系。在rnarna水解时，水解时，2-oh2-oh首先进攻磷首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。物。 dnadna在稀碱的作用下，只会发生变性，在稀碱的作用下，只会发生变性，不会发生磷酸二酯键的水解。不会发生磷酸二酯键

26、的水解。酶水解酶水解1 1、根据底物分类、根据底物分类dnasednase、rnasernase；单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶2 2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶外切酶：外切酶：5 5 端端33 端或端或3 3 端端55 端核酸外切酶。端核酸外切酶。内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)(restriction endonucleases)：能够识别能够识

27、别dnadna分子的特定核苷酸序列，并在识别位点分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开或其周围断开dnadna双链的一类核酸酶双链的一类核酸酶 细菌的限制细菌的限制- -修饰系统：限制性核酸内修饰系统：限制性核酸内切酶（限制酶）特异性强，可在切酶（限制酶）特异性强，可在dnadna特异特异位点切开；位点切开； 概念：概念：在在dnadna特定特定短碱基序列上产短碱基序列上产生某专一性修饰，生某专一性修饰，使得内切酶无法使得内切酶无法识别而不能断裂。识别而不能断裂。 如：修饰甲基化如：修饰甲基化酶。酶。v参与参与dnadna修复及修复及rnarna合成后的剪接等重要基因合成后的剪接等重要

28、基因复制和基因表达过程复制和基因表达过程 v负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 v在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 v体外重组体外重组dnadna技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的生物体内的核酸酶核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解负责细胞内外催化核酸的降解1）核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热呈 绿色，在670nm处可测rna；2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色， 在595nm处可测dna。 二种反应可作定性试验，定量试验灵敏

29、度低、准确性差，但快、简便。l1 1、一个单链、一个单链dnadna和一个单链和一个单链rnarna分子量相分子量相同，试述可以用几种方法将它们区分开？同，试述可以用几种方法将它们区分开？2.转食品基因安全吗？转食品基因安全吗？转基因有两派转基因有两派反对派：反对派的道理在于转基因抗病抗虫的功反对派：反对派的道理在于转基因抗病抗虫的功能来自于毒蛋白基因，虫吃了是要死的，人吃能来自于毒蛋白基因，虫吃了是要死的，人吃了怎么办？了怎么办？赞成派：昆虫的死亡是因为气孔闭塞了，但这跟赞成派：昆虫的死亡是因为气孔闭塞了，但这跟人的消化道完全是两码事。人的消化道完全是两码事。”中间派：中间派：人民不是小白鼠

30、人民不是小白鼠（二）紫外吸收性质 碱基具共轭双键强烈吸收碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm260-290nm波段波段紫外光，最大吸收峰在紫外光，最大吸收峰在260nm260nm附近。附近。l应用：应用：1 1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光紫外分光光度计进行定性、定量测定。光度计进行定性、定量测定。 1 1 odod相当于：相当于：50g/ml dna50g/ml dna 40g/ml rna 40g/ml rna 2、确定所提取的核酸是否纯品。 1）dna： od260/od280 1.8 纯品 2）rna： od260/od280 2.0 纯品

31、 在纯化dna 时,通常用a260/a280=1.8- 2.0 作为纯度标准,若大于此值,表示有rna 污染;若小于此值,则有pro 或酚污染.（三）核酸结构的稳定性1、碱基堆积力：碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏水区；双螺旋内部碱基形成的疏水区；2 2、碱基间的氢键：碱基间的氢键：3 3、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键（四）核酸的变性1、变性的概念变性的概念1）现象现象：双螺旋：双螺旋dna和具双螺旋区的和具双螺旋区的rna氢键氢键 断裂，空间结构被破坏，形成单链无规断裂，空间结构被破坏，形成单链无规 则线团状的过程。则线团状的过程。2）结果结果：a a

32、、增色效应：、增色效应： 260nm260nm紫外吸收增加；紫外吸收增加； b b、粘度下降；、粘度下降；c c、生物学性能部分或全部丧失、生物学性能部分或全部丧失。3 3）引起变性的因素引起变性的因素： 温度、温度、phph、尿素、甲醛等。、尿素、甲醛等。ldnadna变性后，由变性后，由于双螺旋解体，于双螺旋解体，藏于螺旋内部的藏于螺旋内部的碱基暴露出来，碱基暴露出来，使使dnadna的的a a260260值升值升高，这种现象称高，这种现象称为增色效应。为增色效应。00.10.20.30.4220240260280300波长 / nm光吸收变性变性dna天然天然dnatm：在热变性中，紫外

33、在热变性中，紫外吸收增加量达最大增吸收增加量达最大增量一半的温度，称该量一半的温度，称该dnadna的熔解温度的熔解温度（melting temperature,tm);又称又称热解链温度。热解链温度。(g+c)%=(tm -69.3)*2.443、影响tm的因素：1 1）g-cg-c含量：含量：t tm m与与g-cg-c含量成正比。含量成正比。2 2）介质中的离子强）介质中的离子强度：度：离子强度低，离子强度低，t tm m低，在纯水中低，在纯水中, , dnadna 在室温下即可在室温下即可变性。变性。3 3）溶液的）溶液的ph .ph .4) 4) 变性剂变性剂（概念：概念：变性变性d

34、nadna在适当条件下在适当条件下（缓慢降温），（缓慢降温），可可 使两条彼此分开的链使两条彼此分开的链重新缔合重新缔合成双螺旋结成双螺旋结 构的过程。构的过程。 复性后，许多物化性质可得到恢复，复性后，许多物化性质可得到恢复， 生物学活性部分恢复。生物学活性部分恢复。影响因素：影响因素：温度、温度、dnadna片段大小、片段大小、dnadna浓度、碱基浓度、碱基 重复序列多少、离子浓度。重复序列多少、离子浓度。dnadna变性与复性变性与复性l当变性的当变性的dnadna经复性又重新形成双螺经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液的旋结构时，其溶液的a a260260值减小，最值减小，最多可减小

35、至变性前的多可减小至变性前的a a260260值，这种现值，这种现象称为减色效应。象称为减色效应。六、分子生物学技术（一）分子杂交与探针技术1、概念： 1）分子杂交（hybrization): 在退火条件下，不同来源的dna互补区形成氢键，或dna单链和rna链的互补区形成dna-rna杂合双链的过程。 dna-dna： dna-rna: 2)探针（probe)用放射性同位素或荧光标记的dna或rna片段. 确诊病人细胞中提取的dna； 病毒dna ； 肿瘤组织提取的dna。3） southern印迹法用于检测dna方法：如图northern 印迹法印迹法：用于检测用于检测rnarnanort

36、hernnorthern印迹法：将电泳分离后的印迹法：将电泳分离后的rnarna吸印到纤维素膜上再进行分吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。子杂交。n 聚合酶链式反应（pcr）l每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段l广泛用于克隆、测序、产生特异突变、医学诊断和法医. 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。先以外切酶确定5-或3-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列。最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。(五五) 核酸序列分析核酸序列分

37、析酶底物作用部位作用产物外切酶磷酸二酯酶 dna， rna5端，5连接处3核苷酸3端，3连接处5核苷酸内切酶脱氧核糖核酸酶 idna3连接处3-羟核苷酸为3末端寡核苷酸及剩余部分脱氧核糖核酸酶ii5连接处3-核苷酸为3末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸 酶t1rna5连接处碱基是g3-鸟苷酸为3末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸 酶 i5连接处碱基是 pyr3-嘧啶类核苷酸为3末端寡核苷酸及剩余部分dna酶法测序l1977年sanger发明末端终止法测定末端终止法测定dnadna序列。序列。l根据sanger测序法，现在已经有各种dna自动测序仪，dna测序速度大大加快hgp得以提前完成dna酶法测序

38、dna酶法测序平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入dna链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的dna链。这四组dna链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测dna的核苷酸序列,如下图所示： dna酶法测序dna酶法测序l核苷：核苷酸：核苷：核苷酸：campcamp：磷酸二脂键：脱氧：磷酸二脂键：脱氧核糖核酸（核糖核酸（dnadna）：）： 核糖核酸（核糖核酸（rnarna）：）： 核糖体核糖核酸（核糖体核糖核酸（rrnarrn

39、a）：信使核糖核酸）：信使核糖核酸(mrna)(mrna)：转移核糖核酸（：转移核糖核酸（trnatrna）：碱基对：）：碱基对：查盖夫定律（查盖夫定律（chargaffs ruleschargaffs rules）：）： 大沟和小沟：大沟和小沟： dnadna超螺旋：超螺旋： dnadna变性：退变性：退火：熔解温度（火：熔解温度（tmtm）：增色效应：减色效）：增色效应：减色效应应. .l核酸的化学结构：核酸的化学结构：碱基、核苷、核苷酸。碱基、核苷、核苷酸。ldnadna的结构：的结构：dnadna的一级结构、二级结构，的一级结构、二级结构，rnarna的结构：的结构：rnarna的类型和结构特点，的类型和结构特点，trna trna 、mrnamrna、 rrnarrna的结构和功能。的结构和功能。l核酸的性质：核酸的性质：解离性质、水解性质、光吸解离性质、水解性质、光吸收性质、沉降特性，变性、复性及杂交。收性质、沉降特性