第五章第二节pH对发酵的影响及2

1、第五章发酵工艺过程控制第三节 ph对发酵的影响 及其控制一、一、phph值对发酵的影响值对发酵的影响二，发酵过程中发酵过程中phph的变化的变化三、发酵三、发酵phph值的确定和控制值的确定和控制发酵过程的发酵过程的phph 值ph值是微生物代谢的综合反映，又影响值是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。代谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中ph值是不断变化的，通过观察值是不断变化的，通过观察ph值变化规律可以了解发酵的正常与否值变化规律可以了解发酵的正常与否phph值值影响菌体的生长和产物的合成影响菌体的生长和产物的合成phph值值影响酶的活性影响酶的

2、活性phph值值影响微生物细胞膜所带电荷的状态影响微生物细胞膜所带电荷的状态phph值值影响培养基某些组分和中间代谢产物的离影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解解phph值值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变代谢产物的质量和比例发生改变如：如：ph对海藻糖水解酶产生的影响对海藻糖水解酶产生的影响ph菌浓菌浓 ph酶活酶活又如：又如： ：培养基初始：培养基初始phph值对漆酶分泌的影响值对漆酶分泌的影响ph在在47范围内产酶高范围内产酶高漆酶漆酶(laccases)在漆树的永延液汁中可被此酶氧化变成黑色色素的物质是在漆树的永延液

3、汁中可被此酶氧化变成黑色色素的物质是漆酚、氢化漆酚等。漆酚、氢化漆酚等。借助氧将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌的酚氧化酶的一借助氧将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌的酚氧化酶的一种，亦称为对苯二酚氧化酶。种，亦称为对苯二酚氧化酶。是一种结合多个铜离子的蛋白质，蓝色，分子量约是一种结合多个铜离子的蛋白质，蓝色，分子量约12万，万，含含4原子铜。属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。原子铜。属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，发生反应后唯一的产物就是水，因因此本质上是一种此本质上是一种环保型酵素环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被。由于这

4、几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。phph影响菌体的生长影响菌体的生长对微生物发酵来说有各自的最适对微生物发酵来说有各自的最适生长生长ph值值和最适和最适生产生产ph值。值。多数微生物生长都有最适多数微生物生长都有最适ph值范围及其变值范围及其变化的上下限：化的上下限：上限都在上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶；无法忍受而自溶；下限以酵母为最低下限以酵母为最低(2.5)。phph值影响酶的活性值影响酶的活性当当ph值抑制菌体某些酶的活性时会阻碍菌值抑制菌体某些酶的活

5、性时会阻碍菌体的新陈代谢。体的新陈代谢。菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，仅仅是仅仅是酶的种类酶的种类不同而已，因此代谢产物不同而已，因此代谢产物的合成也有自己最适的的合成也有自己最适的ph值范围。值范围。一般认为，一般认为，细胞内的细胞内的h或或oh能影响酶蛋能影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变。功能，引起酶活性的改变。 培养基与胞内培养基与胞内phph培养基的培养基的h或或oh并不是直接作用在胞内并不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(

6、或或弱碱弱碱)上，使之成为易于透过细胞膜的分子上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸状态的弱酸(或弱碱或弱碱)，它们进入细胞后，再，它们进入细胞后，再行解离，产生行解离，产生h或或oh，改变，改变胞内原先存胞内原先存在的中性状态在的中性状态，进而影响酶的结构和活性。，进而影响酶的结构和活性。所以培养基中所以培养基中h或或oh是通过是通过间接作用间接作用来来产生影响的。产生影响的。 phph影响微生物细胞膜所带电荷的状态影响微生物细胞膜所带电荷的状态从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。代谢物

7、的排泄，因此影响新陈代谢的进行。 collnig等人发现产黄曲霉的细胞壁的等人发现产黄曲霉的细胞壁的厚度厚度就就随随ph值的增值的增加而减小加而减小：其菌丝直径在：其菌丝直径在ph6.0时为时为23m；ph7.4时为时为218m，并呈膨胀酵母状；，并呈膨胀酵母状；ph值下降后菌丝形态又会值下降后菌丝形态又会恢复正常。恢复正常。菌体形态变化反映代谢菌体形态变化反映代谢 不同不同phph值对菌体的形态影响很大：值对菌体的形态影响很大：当当phph值高于值高于7 75 5时：时：菌体易于老化，呈现球状；菌体易于老化，呈现球状；当当phph值低于值低于6 65 5时：时：菌体同样受抑制，易于老化。菌体

8、同样受抑制，易于老化。而在而在7 72 2左右时：左右时：菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在在6 69 9左右时：左右时：菌体处于生长期，呈菌体处于生长期，呈“八八”字形状并占有绝字形状并占有绝对的优势。对的优势。phph影响培养基某些组分和中间代谢产物影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解的离解从而影响微生物对这些物质的利用。从而影响微生物对这些物质的利用。 phph不同，往往引起菌体代谢过程的不同，不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变使代谢产物的质量和比例发生改变 例例 ：黑曲霉在黑曲霉在ph23时发酵产生时发酵产生柠檬酸柠檬

9、酸，在，在ph近中性时，则产生近中性时，则产生草酸草酸。 又如：又如：谷氨酸发酵，在中性和微谷氨酸发酵，在中性和微碱性碱性条件下积累条件下积累谷氨酸谷氨酸，在，在酸性酸性条件下则容易形成条件下则容易形成谷氨酰胺和谷氨酰胺和n-乙酰谷氨酰胺乙酰谷氨酰胺由于由于ph值的高低对菌体生长和产物合成产生明显值的高低对菌体生长和产物合成产生明显的影响，所以在工业发酵中，维持最适的影响，所以在工业发酵中，维持最适ph值已成值已成为生产成败的关键因素之一。为生产成败的关键因素之一。（一）、发酵过程（一）、发酵过程ph变化的原因变化的原因 培养基中培养基中营养物质的代谢营养物质的代谢，是引起，是引起ph值变化的

10、值变化的主要原因主要原因 1、基质代谢、基质代谢 （1）糖代谢糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇， 使使ph下降。下降。 糖缺乏，糖缺乏，ph上升，是补料的标志之一。上升，是补料的标志之一。（2）氮代谢氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-nh2被利用后被利用后ph会下降；会下降； 尿素被分解成尿素被分解成nh3，ph上升，上升， nh3利用后利用后ph下降，下降， 当碳源不足时氮源当碳源利用当碳源不足时氮源当碳源利用ph上升。上升。二，发酵过程中ph的变化生理碱性物质、生理酸性物质无机氮源无机氮源特点：微生物对它们的吸收快，特点：微生物对它们的

11、吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起源的迅速利用常会引起ph的变化。的变化。经微生物生理作用（代谢）经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如物质，如硫酸胺硫酸胺。若菌体代谢后能产生碱性若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如如硝酸钠硝酸钠。生理碱性物质、生理酸性物质无机氮源无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。中就留下了酸性或碱性物质。 (nh4)2so4

12、2nh3 + 2h2so4 nano3 + 4h2 nh3 + 2h2o + naoh正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的发酵过程的ph值有积极作用。值有积极作用。2.培养基培养基引起引起ph值下降的因素值下降的因素v碳源过量碳源过量v消泡油添加过量消泡油添加过量v生理酸性物质的存在生理酸性物质的存在引起引起ph值上升的因素值上升的因素v氮源过多氮源过多v生理碱性物质的存在生理碱性物质的存在v中间补料，碱性物质添加过多中间补料，碱性物质添加过多发酵过程发酵过程phph值变化的原因值变化的原因如：如： 培养基培养基对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的

13、影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液发酵液ph下降，待有机酸被生产菌利用，下降，待有机酸被生产菌利用，ph上升。若不及上升。若不及时时补糖、补糖、(nh4)2so4或酸或酸，发酵液，发酵液ph可迅速升到可迅速升到8.0以上，阻以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。 对照罐发酵对照罐发酵66小时小时ph达达7.93，以后维持在，以后维持在8.0以上至以上至115小时，菌丝浓度降低，小时，菌丝浓度降低，nh2-n升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。 发酵发酵

14、15小时左右，小时左右，ph值可以从稍后的值可以从稍后的6.5左右下降到左右下降到5.3，调节这一段的调节这一段的ph值至值至7.0左右，以后自控左右，以后自控ph保持保持7.0，可提高，可提高发酵单位。发酵单位。ph7.0t不调不调ph调调ph效价效价ph3 3、产物形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液ph变化。变化。如有机酸类产生使如有机酸类产生使ph下降；下降；红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使性，使ph上升。上升。 4 4、菌体自溶菌体自溶，ph上升，发酵后期，上升，发酵后期，ph上升。上升。 发

15、酵过程发酵过程phph变化的原因变化的原因1.ph1.ph的确定的确定根据实验结果根据实验结果配制不同配制不同初始初始ph的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况ph对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响三、发酵三、发酵phph值的确定和控制值的确定和控制菌体有一定的自调ph值能力phph在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 生长合成ph对菌体生长影响比产物合成影响小（同温度）对菌体生长影响比产物合成影响小（同温度）例例 青霉素：菌体生长最适青霉素：菌体生长最适ph3.56.0, 产物合成最适产物合成最适ph7.27.4 四环素：菌体生长最适四

16、环素：菌体生长最适ph6.06.8， 产物合成最适产物合成最适ph5.86.0xpph四环素四环素在不同的发酵阶段所要求的在不同的发酵阶段所要求的phph值不同值不同如：如：谷氨酸谷氨酸 发酵前期：控制发酵前期：控制ph=7.5左右左右 发酵中期：控制发酵中期：控制ph=7.2左右左右 发酵后期：控制发酵后期：控制ph=7.0左右左右 将近放罐时：将近放罐时： ph=6.56.8为好为好如：如：初级代谢产物丙酮、丁醇的梭状芽孢杆菌的发酵初级代谢产物丙酮、丁醇的梭状芽孢杆菌的发酵ph在中性时，菌体生长良好，但产物产量低。在中性时，菌体生长良好，但产物产量低。实际发酵合适实际发酵合适ph值为值为5

17、6。又如：又如：次级代谢产物抗生素发酵次级代谢产物抗生素发酵链霉素产生菌生长的合适链霉素产生菌生长的合适ph值为值为6.27.0，而合成链霉素的合适而合成链霉素的合适ph值为值为6.87.3。 因此按发酵过程的不同阶段分别控制不同的因此按发酵过程的不同阶段分别控制不同的ph范围，使范围，使产物的产量达到最大产物的产量达到最大 。最适最适phph值的确定值的确定生长生长最适最适ph值的确定：值的确定：将发酵培养基调节成不同的出发将发酵培养基调节成不同的出发ph值进行发酵，值进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节在发酵过程中，定时测定和调节ph值以维持出发值以维持出发ph值，或者利用缓冲液配制培养

18、基来维持之。定值，或者利用缓冲液配制培养基来维持之。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的的ph值为菌体生长的最适值为菌体生长的最适ph值。值。产物合成产物合成的最适的最适ph值的确定：值的确定：以同样的方法，可测得产物合成的最适以同样的方法，可测得产物合成的最适ph值。值。最适ph值确定的条件但同一产物的最适但同一产物的最适ph值，还与所用的值，还与所用的菌种菌种、培养培养基组成基组成和和培养条件培养条件有关。有关。如：如：合成青霉素的最适合成青霉素的最适ph值，先后报告有值，先后报告有7.27.5、7.0左右和左右和6.56.6等不同数值，

19、产生这样的等不同数值，产生这样的差异，可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工差异，可能是所用的菌株、培养基组成和发酵工艺不同引起的。艺不同引起的。在确定发酵最适在确定发酵最适ph值时，要不定期考虑培养温度值时，要不定期考虑培养温度的影响，的影响，若温度提高或降低，最适若温度提高或降低，最适ph值也可能发值也可能发生变动。生变动。2 2、phph的控制的控制a. a. 和和q qp p的最适的最适phph值的值的 几种情形几种情形在各种类型的发酵过程中，在各种类型的发酵过程中，实验所得的实验所得的最适最适ph值值菌体的菌体的比生长速率比生长速率和和产物产物比生成速率比生成速率qp等等3个参数的相互

20、关系有四种情况：个参数的相互关系有四种情况： (a) 和和qp的最适的最适ph值都在一个相似的较宽值都在一个相似的较宽的适宜范围内，这种发酵过程易于控制；的适宜范围内，这种发酵过程易于控制； (b) qp的最适的最适ph值范围很窄，而值范围很窄，而的的范围较宽；或反之。范围较宽；或反之。 (c) 和和qp对对ph值都很敏感，它们的值都很敏感，它们的最适最适ph值又是相同的。值又是相同的。第三种情况的发酵第三种情况的发酵ph值应严格控值应严格控制；制；(d)第四种情况更复杂，第四种情况更复杂，和和qp有各自有各自的最适的最适ph值，应分别严格控制各值，应分别严格控制各自的最适自的最适ph值，才能

21、优化发酵过值，才能优化发酵过程。程。b .b .控制方法控制方法首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的它们有个适当的配比，使发酵过程中的ph值变化值变化在合适的范围内。在合适的范围内。 （1 1）调节好基础料的）调节好基础料的phph。基础料中若含有玉米浆，基础料中若含有玉米浆，ph呈酸性，必须调节呈酸性，必须调节ph。若要控制若要控制消后消后ph在在6.0，消前消前ph往往要调到往往要调到6.56.8。 （2）在基础料中加入维持）在基础料中加入维持ph的物质。的物质。如代谢产酸物质：葡萄糖（产酮酸）、（如代谢产酸

22、物质：葡萄糖（产酮酸）、（nh4)2so4产碱物质：产碱物质：nano3、尿素、尿素缓冲剂：缓冲剂：caco3、磷酸缓冲液等、磷酸缓冲液等在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料与调与调ph没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调ph如如 调节补糖速率；调节补糖速率；消泡剂消泡剂(如豆油如豆油)的个别情况下，的个别情况下， 还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，来来 调节调节ph 当当nh2-n低，低，ph低时低时补氨水；补氨水； 当当nh2-n低，低，ph高时高时补补(nh4)2so4 当补料与调当

23、补料与调ph发生矛盾时，加酸发生矛盾时，加酸 碱调碱调ph （3 3）、通过补料调节）、通过补料调节phph 分别在分别在4 4种缓冲介质中，种缓冲介质中，于于ph 6ph 65050一一9 95050测定天测定天冬酰胺酶酶活力冬酰胺酶酶活力1 1 甘氨酸介质甘氨酸介质ph 8.00ph 8.00时时酶活力最高；酶活力最高；2 2 硼酸在硼酸在ph 8ph 85050，酶反，酶反应最快应最快3 3 磷酸磷酸在在ph 850，酶反，酶反应最快应最快4 tris4 tris（三羟甲基氨基甲烷）三羟甲基氨基甲烷）在在ph 850，酶反应最快，酶反应最快酶活酶活1 12 24 43 3c c、不同调节

24、、不同调节phph方法产生的影响方法产生的影响不同缓冲介质对天不同缓冲介质对天冬酰胺酶的影响冬酰胺酶的影响不同不同phph控制方式对目的突变株控制方式对目的突变株isw330isw330异亮氨酸摇瓶异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。发酵的影响，结果如图所示。“1”1”表示只加表示只加cac0cac03 3控制控制phph值，值，“2”2”表示只加尿素控制，表示只加尿素控制，“3”3”表示表示cac0cac03 3和尿素联合控制和尿素联合控制phph值值。异亮氨酸发酵异亮氨酸发酵例：例：ph对对l-异亮氨酸发酵的影响异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）（天津科技大学）菌株最适生长菌株最适生长p

25、hph控制在控制在6.86.87.07.0d d、发酵的不同阶段采取不同的、发酵的不同阶段采取不同的phph值值ph6ph69 9时：时：菌体生长旺盛，菌体生长旺盛，ph7ph71515时：时：对菌体的产酸有利。对菌体的产酸有利。因此，采用阶段因此，采用阶段phph控制模式进行发酵：控制模式进行发酵：发酵中前期：发酵中前期：控制控制ph6.9ph6.9，到到48h48h后：后： phph值为值为7.157.15，到到80h80h后：后： phph值为值为7.257.25。产率产率222227g27g/l/l，产酸率提高，产酸率提高12122323。例：克拉维酸发酵中例：克拉维酸发酵中ph变换控

26、制变换控制问题的提出：问题的提出：在在ph低时低时 : 菌体生长受抑制，菌体生长受抑制，在高在高ph时时 : 克拉维酸会分解克拉维酸会分解用用2.52.5升罐进行的升罐进行的不控制不控制phph的发酵发现的发酵发现: :前期前期: :由于微生物产生的由于微生物产生的酸性副产物酸性副产物和和有机酸有机酸使使ph7ph7 降至降至6.56.5。 达到最高细胞浓度后达到最高细胞浓度后: : ph ph开始从开始从6.56.5升至升至8.38.3。caca产量达最高水平时产量达最高水平时: : ph ph不再升高。不再升高。在发酵终止时在发酵终止时: : ph ph再次升至再次升至8.58.5。随着。随着phph升高，升高，caca迅迅 速分解。速分解。克拉维酸克拉维酸对各种对各种-内酰胺酶有强抑制内酰胺酶有强抑制作用。生产菌为棒作用。生产菌为棒状链霉菌状链霉菌 。研究不同研究不同ph对对克拉维酸克拉维酸clavulanic acid发酵的影响发酵的影响分别配置分别配置p