内毒素及其去除

1、鞭毛荚般细胞壁细胞膜核区细胞质内毒素是什么内毒素也称为脂多糖或 LPS,是革兰氏阴性菌 胞壁上一种成分（少数 阳性菌也能产生）。其 细胞壁外膜的外部脂质 成分完全由内毒素分子 组成，死亡时则会释 放大量内毒素。一个大 肠杆菌细胞约含有200 万个LPS分子功能部分结构复杂， 特异性部分带负电0-特异侧链核内K8A多糖不同的革兰氏阴性细菌，其LPS的化学组成有一定的差别 ，但都含有内脂A部分内辜素性质GalOalNO.NGaNGCn = 4 40 O-AntigenGAcHpHicpLipid ACore oligosaccharideI Gil I Ga |NGaCell exteriorCe

2、ll interior极高的热稳定性亲水兼疏水250七 30分钟水水亲疏唐9曰s flDetergents. EDTAfCholic acidsiMcrrorTw)： 1KD吕内毒素存在形式cations1 Detergents (Proteins)5 : BivalentBivalent cations“EDTA(Proteins)Micelles制二 300000 kDaVesiclesMr 1000 kDa内毒素的危害医药制剂本身不合格或放置 时间过长输液器未消歩彻底注射器操作污染死亡2ng/kg体重即能引起发热头痛恶心，呕吐，脸色苍白血液循环障碍休克生物制品中内毒素标准药品、生物制品的

3、(，EU/mg) 一般按以下公式确定：我国药典要求注射剂中细 菌内毒素VIEU/ml细菌內毒素标准在制定时应定为计算值的1/31/2。K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，单位EU/ (kg h) M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，单位mg/ (kg h)常用内毒素检测方法凝胶法显色基质法内毒素与 蛍试剂的 凝胶反应大于0.03EU/ml范冃0.006-300EU/mL浊度变化C3部分药品由 于自身特殊 性无法通过 稀释法消除 干扰，因此 蛍试验还无 法完全取代 家兔热原试 验缓慢翻转180 ,目测皱占k0八、简单，经济，不需专用测定设备特异性不强精密度、定量性差简单、快速、灵敏

4、 度高、检测范围宽需精密的专用仪器0.006-15EU/ml显色基团吸光度变化精度高、灵敏度高仪器和试剂贵, 操作比较复杂肉毒素去除的难点自身特点相互作用极少的养分G-即可存活,内毒几乎无处不在本身带负电，可以和带正电的碱性蛋白结合单体、聚集体种类繁多性质不均一内毒素通过二价阳离子（如Ca2+）的桥接作用和酸性蛋白形成复合体热稳定性高180C 3 hours类脂A的疏水特性导致 其和疏水性蛋白结合去除内毒的方法1.高温烘烤热原的耐热性能良好，60C加热不被分解破坏，100C不降解 ,但180C34h. 200C60min或25093045口讪可使热原彻底 破坏。此法适合玻璃器皿的去内毒2碱消毒

5、（室温条件下）主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒耒的去除4蒸馅法，超滤法，反渗透，此法一般在生产注射用水 时用到，蒸徭需要多级蒸徭并且加隔沫装置，反渗透成 本咼。5吸附法，内毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶 土等吸附而除去。由于对蛋白有吸附故不适合用于生物 制品O6层析法，选用合适的层析填料和溶液体系，能够有 效去除产品中的内毒素，是目前单抗纯化生产中的主 流工艺。7相分离法、适用于蛋白制品，但各有缺点。内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介 绍几种生产中常用的方法U!相分离法Triton X-114阴离子交换层析(疏水层析与分子筛(O亲和层析此法用于较大重组

6、蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除 ,经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/mI, 去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的Triton X-114残存在蛋白溶液中阴离子交换层析离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好 ，在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言, 内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强 很多，分子量越小的内毒素结合得越强，多数要 在柱再生（1M氯化钠）或在位清洗（1M氢氧化钠 ）时才从介质上洗脱下来内毒素在pH 2时都是带负电。阴离子层析填料自身带 正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品P

7、H控 制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在 填料上，目的蛋白直接流穿成本低，吸附容量大， 但这种方法不适用于带 负电荷的蛋白如二乙胺乙基(DEAE)阴 离子交换介质适于从碱性蛋 白质(即带正电的蛋白质， 如尿激酶)中去除内毒素，疏水与分子筛疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合，而在 高盐体系中内毒素由于脂质A部分有很强的疏水性发凝 集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的 一种方法。一般抗体分子量为几万道尔顿，而内毒素分子 量为几十万至上百万道尔顿，常是多聚体，因此利用分子筛 可以有效去除内毒素，但其处理量小，处理时间较

8、长。亲和层析亲和层析以组氨酸、组胺、多粘菌素B、聚阳离子等为配基将内毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于 CNBr-Sepharose 或N HSSepharose上,以此介质特 异性吸附内毒素,而让蛋白通过0nh2nh2nh2亲和层析A (E5d) docEGOeou LHX04OPUCJU45050- Endotoxin concentration Removal efficiencyoo o0250.500.750090Ro70605000 Eiidvtoxiii conuentiation Removal(?flici?ncy一 Hb recovery0.250.500.7500

9、($) A。一一勺ost)rtAOUKQf10090807060500020Cxi (mol/L)CSaa (mol/L)图3 NaCl浓度对内毒素去除的彩响Fig. 3 Effect of NaCl concentration on endotoxin removal. (A) Aqueous solution. (B) Hb solution.亲和配基PMB与内毒素之间的作用主要是疏水与静电作用，而盐浓度即 离子强度的变化会反方向影响这两种作用：离子强度增大会增强亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用，同时又会减 小两者之间的静电作用；离子强度减小会减小亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用，

10、同时又会增 大两者之间的静电作用。疏水作用与静电作用的协同作用导致了上述结 果。亲和层析50-001145000 Endotoxin concentration 一一 Removal efficiency5056789MHOm300150605678900町0 o1 ox 8 775502560pHpH图2 pH值对内毒素去除的影响Fig. 2 Effect of pH on endotoxin removal. (A) Aqueous solution. (B) Hb solution.在低pH时，内毒素分子中磷酸酯基和竣基离子化减小。在分子内疏 水作用的驱使下内毒素分子趋于更为紧凑的结构，

11、从而减少了相互 作用的位点，导致去除率的下降。随着溶液pH的增大，内毒素分子的 紧凑结构被分子内静电相互作用破坏，舒展的结构使内毒素分子与 固载于琼脂糖上的配基产生更为有效的作用，导致去除率的升高。 在高pH下内毒素去除率的下降可能是因为键合于基质上的疏水配 基的构像发生扭曲变形所致。多种层析方法组合效果生物技术药品的纯化, 主要是采用各种柱层 析技术，如疏水层析、 离子交换、亲和层析、分子筛等，这些技术 纯化目标产品的同时 也可以有效去除内毒 素 Ak表1Blue-scpharosc亲和柱层析结果Table 1 The results of Blue-sepharose affinity c

12、hromatographDetection, itemFermentation broth Target peak AEndo toxin/( EU/mg)Purity/%653062.11054786.2Detection itemTargot peak ATarget peak BEn-dotaKin/(E U/mg)10547597PuTity/%86.295.7表3 Q Sepharose F.F.离子交换层析结果Table 3 The results of Q Sepharose F.F. ion exchange chromatographyDetection itemTarget peak BTarget peak CEndotoxin/( EU/mg)5975Purity/%95.797.2表4 Sephadex G25 Coarse凝胶过滤层析结果 Table 4 The results of Sephadex G25 Coarse filtration chromatographyDetection itemTarget peak CTarget peak DEndotoxin7( EU/mg)5IPuri