chap DNA重组的操作PPT教学课件

1、6.1 DNA的体外重组的体外重组黏、平端连接同聚物加尾人工接头gateway克隆第1页/共64页6.1.1 黏黏端连接端连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoR I5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 5 AATTCG 第2页/共64页特点特点操作简便正反向插入载体自连串联重组体第3页/共64页同尾酶同尾酶第4页/共64页BamH I5 5GGATCCCCTAGGGGATCCC

2、CTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 Bcl I第5页/共64页第6页/共64页6.1.2 平端连接平端连接连接效率低方向不确定多拷贝插入n同聚物同聚物加尾加尾n衔接物连接衔接物连接n接头连接接头连接第7页/共64页C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGGG3 AA

3、AAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTCAAAAAAAAAA 3 第8页/共64页5突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow补平补平Klenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGG

4、GCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamH IBamH IEcoR IBamH I第9页/共64页3突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCA

5、TGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I第10页/共64页特点特点无自身环化连接效率高操作繁琐插入片段回收第11页/共64页n平端平端dsn8 12 bpn酶切点酶切点衔接物连接衔接物连接第12页/共64页5 -GATCCCCGGG-3 3 -GGGCCCTTAA-5 5 GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5 GCCTAG-5 5 3 GATCCCCGGG-3

6、 GGGCCCTTAA-5 GCCTAG5 3 fragment with EcoRI compatible endsannealligationfragment withBamHI sticky ends接头分子连接接头分子连接第13页/共64页6.1.3 Gateway载体系统载体系统第14页/共64页第15页/共64页特征特征位点重组重组保守核心序列拓扑结构第16页/共64页溶源溶源: :Int & IHF裂解裂解: :Int、 Xis、 IHF第17页/共64页Gateway克隆技术的特点克隆技术的特点 快速高效 不同载体间转换 避免假阳性 成本;载体扩增第18页/共64页n物理法物理

7、法n化学法化学法n生物学生物学6.2 重组重组DNA的转移的转移第19页/共64页6.2.1 重组体导入重组体导入E.c第20页/共64页Ca+2诱导诱导E.coli转化转化第21页/共64页电穿孔法电穿孔法n高压放电高压放电n瞬间通道瞬间通道n膜恢复膜恢复第22页/共64页第23页/共64页6.2.2 重组体导入真核细胞重组体导入真核细胞 原生质体法 Li+介导法 PEG法 电击法1. 导入酵母细胞导入酵母细胞蜗牛酶蜗牛酶(5mg/ml,3.5h)第24页/共64页2. Gene transfer to plants载体介导直接导入种质系统法第25页/共64页外植体外植体伤口伤口共培养共培养

8、A.tASAp、头孢头孢转化和非转化转化和非转化kan、hyg转化组织转化组织转化苗转化苗整合整合YFG + Ti 重组质粒重组质粒 转化转化Agro第26页/共64页virA受体受体virG活化蛋白活化蛋白vir启动子区启动子区virB、D、E接合孔复合体接合孔复合体加工加工、转运转运整合整合第27页/共64页Electroporation第28页/共64页Microprojectile bombardment 简 便简 便、靶 受 体靶 受 体广广、安 全 无 污安 全 无 污染染 随 机 整 合随 机 整 合、嵌嵌合 体合 体、转 化 率转 化 率低低 Biolistic PDS-100

9、0 (He)Helium system第29页/共64页化学法化学法lPEG、pLO、磷酸钙磷酸钙l原生质体原生质体伤害小伤害小; ;无嵌合体无嵌合体再生难再生难; ;无性系变异大无性系变异大第30页/共64页Pollen tube pathway卵细胞或合子卵细胞或合子无需培养无需培养、再再生生简便易行简便易行周光宇周光宇(1918-2007)第31页/共64页6.2.4 Gene transfer to animal cells磷酸钙沉淀病毒感染显微注射脂质体法Microinjector(ZEISS)n胚胎细胞胚胎细胞转化率高转化率高细胞固定细胞固定技术苛刻技术苛刻第32页/共64页Lip

10、id vesicles(A) An electron micrograph of unfixed, unstained phospholipid vesicles, liposomes, in water rapidly frozen to liquid nitrogen temperature. The bilayer structure of the liposomes is readily apparent. (B) A drawing of a small spherical liposome seen in cross section. (C) A liposome is a sma

11、ll aqueous compartment surrounded by a lipid bilayer第33页/共64页第34页/共64页Transduction & TransfectionnTransduction: This describes virus-mediated gene transfer. Certain animal viruses naturally infect human and mammalian cells. They include both DNA viruses (SV40, adenovirus) and RNA viruses (retrovirus

12、es). Modifications of these viruses can be used as vectors to transfer exogenous genes into suitable target cells at high efficiency. nTransfection: This describes nonviral mediated gene transfer. It is analogous to the process of transformation in bacteria. Gene transfer can be carried out by vario

13、us methods. 第35页/共64页5. 转化率及其影响因素转化率及其影响因素n转化细胞与细胞总数之比转化细胞与细胞总数之比转化率转化率= 转化子数转化子数/受体细胞总数受体细胞总数n每每 g DNA所产生的转化子数所产生的转化子数转化率转化率= 转化子数转化子数/每每 g DNA1 g pMD18有有3.4 1011分子分子108/3.4 1011 = 1/3400第36页/共64页 已知转化率和RF可以帮助设计重组实验的规模转化率的用途转化率的用途某重组实验某重组实验RF=20%, 转化率转化率107/ g载体载体, 切接处理的载切接处理的载体转化率比天然的低体转化率比天然的低100

14、 , 欲获得欲获得104个重组克隆个重组克隆, 需投需投入多少载体分子？入多少载体分子？若若Rf =1, 产生产生104个重组子个重组子: 104/(107 0.01) = 0.1 g DNARF =20%, 投入载体投入载体: 0.1/20% = 0.5 g按按10:1投入投入,5 104个克隆个克隆,1000克隆克隆/皿皿,需涂布需涂布?第37页/共64页转化率的影响因素转化率的影响因素载体构象受体细胞转化手段SC最高最高,切接切接100 大质粒大质粒, 转化率转化率原生质体原生质体 105106Ca2+ 104105/ g 转染转染 107108电击电击 108109 第38页/共64页

15、6.3 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 直接筛选DNA鉴定载体特性 间接筛选 -葡糖苷酸酶检测葡糖苷酸酶检测第39页/共64页转化子和重组子转化子和重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞 含有重组DNA分子的转化子 含有目的基因的重组子第40页/共64页ROPROISal IBamH ITcPvu IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori转化子转化子/非非重组子重组子/非非6.3.1 遗传学检测法遗传学检测法1. 抗药性筛选法抗药性筛选法第41页/共64页基本操作基本操作转化液涂平板重组子: Apr Tcs

16、非重子: Apr TcrApAp + Tc影印影印挑选挑选第42页/共64页环丝氨酸的富集作用环丝氨酸的富集作用 Tc抑制Tcs生长, 不致死 环Ser杀死分裂细胞转化菌Cs +TcTcs被富集离心去TcAp平板Apr Tcs第43页/共64页转化子/非 pUC18AprlacZoriAp + X-gal重组子重组子 Apr + lacZ- 2. 显色筛选法显色筛选法重组子重组子/非非 第44页/共64页PlaclacZ MCSOHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNX-galN端端lacZ F lacZM15C端端lacZ显色原理显色原理第45页/共64页 -互补

17、互补n基因内互补基因内互补 肽肽 + 片段片段蓝色蓝色无互补无互补白色白色第46页/共64页E.c: trp; 哺乳类: tkdCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTTK 3. 营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法全合成途径全合成途径应急途径应急途径第47页/共64页6.3.2 分子杂交检测分子杂交检测菌落原位杂交dot blotSouthern blotNorthern blot第48页/共64页1. 菌落原位杂交菌落原位杂交影印影印变性变性中和中和杂交杂交感光感光洗涤洗涤杂交杂交感光感光第49页/共64页2 斑点杂交斑点杂交第50页/共64页3. Southern & Nor

18、thern blot片段大小片段大小基因鉴定基因鉴定基因转录基因转录表达调控表达调控第51页/共64页 凝胶电泳法 酶切图谱法RF与分子大小快捷、易行多转化子检测6.3.3 物理检测法物理检测法第52页/共64页区分目的重组子区分目的重组子 E + B酶切3 + 3.7 kb或 1 + 5.7 kb P + B酶切3.2 kb + 3.5或 0.8 kb + 5.9 pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4 kb1 kb0.8 kb第53页/共64页酶解图谱分析酶解图谱分析 E酶: 2和2.7 kb2.7 kb2.0 kbpUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBE4 kb2 kb2 kbE第54页/共64页酶解图谱分析酶解图谱分析B全: