微核检测技术郭

1、植物微核检测技术植物微核检测技术哈尔滨师范大学哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院生命科学与技术学院遗传教研室遗传教研室2010年年3月月背景知识背景知识毒理遗传学毒理遗传学：o 或称遗传毒理学，用遗传学方法研究或称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素环境因素对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支学科，学科，提供了许多迅速、准确、简便的方法来检提供了许多迅速、准确、简便的方法来检测各种环境因素对遗传结构的危害，以便采取措测各种环境因素对遗传结构的危害，以便采取措施，减少这些因素对人类的危害。施，减少这些因素对人类的危害。o 应用应用：评价各种化学物的安全

2、性评价各种化学物的安全性（药物的临床过药物的临床过渡）渡），人类环境的现场监测、人群健康监测，人类环境的现场监测、人群健康监测（职职业病的防治）业病的防治）以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查等。病学调查等。环境中可产生诱变的因素：环境中可产生诱变的因素：1.1. 物理诱变物理诱变：如紫外线，：如紫外线，x-x-射线，射线，-射线，快中子，射线，快中子，激光，微波，离子束等。激光，微波，离子束等。2.2. 化学诱变化学诱变：如烷化剂：如烷化剂( (包括包括emsems、eiei、neuneu、nmunmu、desdes、mnngmnng、ntgntg等等) )，

3、天然碱基类似物，天然碱基类似物, ,氯化锂、亚氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等嵌入染料。胺和吖啶等嵌入染料。3.3. 空间诱变空间诱变：宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空：宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器进行搭载。间站及航天飞机等空间飞行器进行搭载。4.4. 复合诱变复合诱变：两种或多种诱变剂的先后使用。：两种或多种诱变剂的先后使用。环境因素造成的遗传毒理效应：环境因素造成的遗传毒理效应：“三致效应三致效应”1. 突变形成突变形成：环境因素诱发：环境因素诱发生殖细胞生殖细胞的基因突变（点的基

4、因突变（点突变）和染色体畸变，从而造成子代遗传性疾病发突变）和染色体畸变，从而造成子代遗传性疾病发生频率的增加，生频率的增加，2. 癌形成癌形成：环境因素诱发：环境因素诱发体细胞基因突变体细胞基因突变或在亲代遗或在亲代遗传的突变形成的背景上诱发体细胞突变，引起的体传的突变形成的背景上诱发体细胞突变，引起的体细胞恶性转化为细胞恶性转化为癌癌细胞的作用；细胞的作用；3. 致畸效应致畸效应：环境因素作用于发育中的：环境因素作用于发育中的胚胎细胞胚胎细胞干扰干扰了基因的正常作用，从而影响到胚胎细胞分化和器了基因的正常作用，从而影响到胚胎细胞分化和器官系统的发育而导致官系统的发育而导致畸胎畸胎的发生，也

5、包括环境因素的发生，也包括环境因素诱发亲代生殖细胞的基因突变或染色体畸变引起畸诱发亲代生殖细胞的基因突变或染色体畸变引起畸胎的作用。胎的作用。肿瘤的发生和类型肿瘤的发生和类型“三致效应三致效应”的检测方法：的检测方法：o早期的方法早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物或：用待测化学物质喂饲、注射动物或涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患肿瘤或出现畸胎等，可检测各种化学物质的致癌肿瘤或出现畸胎等，可检测各种化学物质的致癌和在胚胎发育过程中的致畸效应。和在胚胎发育过程中的致畸效应。o现在现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和人一般都采用细菌、离体

6、培养的哺乳动物和人类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有：类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有： 以以基因突变基因突变为指标的检测法为指标的检测法 以以染色体染色体为指标的方法为指标的方法以以染色体为指标染色体为指标的的“三致三致效应效应”的检测方法：的检测方法： 1.1. 经典的染色体畸变分析方法；经典的染色体畸变分析方法；2.2. 姐妹染色单体互换测试法；姐妹染色单体互换测试法；3.3. 微核微核测试法。测试法。（1）断片）断片（2）双着丝点）双着丝点（3）环）环微核微核遗传毒理评价所用的材料：遗传毒理评价所用的材料：1. 利用利用植物植物、昆虫昆虫（果蝇）（果蝇）、水生动物水生动物等生

7、物的细胞等生物的细胞可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的存在。为此，发展了存在。为此，发展了紫露草紫露草花序花序、蚕豆蚕豆根尖、根尖、鱼鱼红红细胞细胞遗传毒性试验方法以及遗传毒性试验方法以及ames（原生动物原生动物）空气现场采样方法等。空气现场采样方法等。 2. 动物细胞动物细胞：小鼠：小鼠骨髓骨髓细胞、外周血细胞、外周血淋巴淋巴细胞等。细胞等。3. 应用多种应用多种人类细胞人类细胞：口腔粘膜口腔粘膜细胞、细胞、鼻腔粘膜鼻腔粘膜细胞、细胞、头皮毛囊头皮毛囊细胞、细胞、痰液痰液细胞等检测微核、染色体畸变、细胞等检测微核、染色体畸变、姐妹染色单

8、体互换率等指标，对人类接触遗传毒物姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物的剂量及效应进行评价。的剂量及效应进行评价。微核测试法微核测试法： （micronucleus test, mnt）o 20世纪世纪70年代初期由年代初期由matter和和schmid首先建立了一种简便、快速、评价客观地检首先建立了一种简便、快速、评价客观地检测来自环境中的各种理化及生物因子对机体测来自环境中的各种理化及生物因子对机体产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核（髓嗜多染红细胞微核（polychromatic erythrocyte, pce）出现率的

9、实验方法。）出现率的实验方法。o 由于大量新的化合物的合成、原子能的应用、各种由于大量新的化合物的合成、原子能的应用、各种工业废物的排出，需要有一套高度灵敏、技术简单工业废物的排出，需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核生物的测的测试系统来监视环境的变化。只有真核生物的测试结果更能直接推测反映诱变物质对人类或其他高试结果更能直接推测反映诱变物质对人类或其他高等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方法。法。o 目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、食品添加剂

10、、新药试验、染色体遗传化学诱变剂、食品添加剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。疾病及癌症前期诊断等各方面。智能全自动智能全自动微核分析微核分析系统：系统：o 法国法国imstar本实验的目的：本实验的目的：1. 通过植物根尖微核试验，学习微核的制片通过植物根尖微核试验，学习微核的制片技术、识别及计数方法。技术、识别及计数方法。2. 掌握评价理化因子对机体遗传损伤的快速掌握评价理化因子对机体遗传损伤的快速筛选方法。筛选方法。实验原理：实验原理：o 微核微核（micronucleus, mn）是真核生物）是真核生物细胞中的一种异常结构。由于细胞经辐射或细胞中的一种异常结构。由于细胞

11、经辐射或化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色体单体或染色体断片，游离于子细胞质中形体单体或染色体断片，游离于子细胞质中形成的次核。在成的次核。在间期间期细胞中，常常见到比普通细胞中，常常见到比普通细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直径大约相当于细胞直径的径大约相当于细胞直径的1/201/3。o 微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。实验材料：实验材料：o 毛葱（毛葱（allium fistulosu

12、m）根尖。）根尖。实验器材：实验器材：o 显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子，显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精灯，指管等。灯，指管等。试剂试剂1. 环磷酰胺（环磷酰胺（cp）2. 卡诺氏（卡诺氏（carnoys）固定液）固定液3. 希夫（希夫（schiffs）试剂）试剂4. 45%醋酸醋酸5. 1 n盐酸盐酸实验步骤：实验步骤：根尖的培养根尖的培养环磷酰胺处理环磷酰胺处理固定固定解离解离染色染色压片压片镜检及观察镜检及观察实验材料实验材料准备准备临时装片临时装片制片制片细胞学鉴定细胞学鉴

13、定诱变处理诱变处理实验材料准备实验材料准备 诱变处理诱变处理1. 毛葱沙培生根，室温下毛葱沙培生根，室温下2-3天即长出天即长出0.5 1cm长的根；长的根；2. 置于置于环磷酰胺溶液中环磷酰胺溶液中处理处理24小时；小时；3. 从药液中取出，水洗后清水培养从药液中取出，水洗后清水培养24 小时；小时；4. 水洗后用水洗后用carnoys固定液固定固定液固定24小时，小时，水洗，转入水洗，转入70%乙醇中保存。乙醇中保存。临时装片制片临时装片制片 细胞学鉴定细胞学鉴定1. 解离解离：取：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用乙醇中保存的根尖水洗两次，用1n hcl 在在60处理根尖处理根尖8-1

14、0min后，水洗后，水洗34次，每次次，每次5min。2. 染色染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（schiff ）试剂染色试剂染色30min2h。3. 压片压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一滴滴45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。4.

15、 镜检及观察镜检及观察。结果及分析：结果及分析：1. 细胞学观察：细胞学观察：o在细胞分裂间期，微在细胞分裂间期，微核呈圆形或椭圆形，核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大游离于主核之外，大小在主核的小在主核的1/3以下，以下，折光率及细胞化学反折光率及细胞化学反应性质和主核一样。应性质和主核一样。蚕豆根尖微核照片蚕豆根尖微核照片2.微核率计算微核率计算o 微核率（微核率（mcn%o o）= 微核数微核数/细胞数细胞数1000%o o微核检测记录表微核检测记录表片号片号细胞数细胞数微核数微核数微核千分率微核千分率第一片第一片第二片第二片第三片第三片总计总计作业和思考题：作业和思考题：1. 叙述微核形成原理。叙述微核形成原理。2.