DB51∕T 2403-2017 野生大熊猫粪便样品采集及DNA提取技术规程

1、ICS 65.020.40B 61DB51四川省地方标准DB51/T 24032017野生大熊猫粪便样品采集及 DNA 提取技术规程2017 - 09 - 19 发布2017 - 10 - 01 实施四川省质量技术监督局发 布库七七 标准下载DB51/T 24032017目次前 言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 采样频次、时间和样线设计15 粪便样品的采集和保存方法2附录 A（规范性附录）大熊猫粪便样品采集记录表4附录 B（规范性附录）四川各保护区大熊猫粪便样品编号5IDB51/T 24032017前言本标准根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的

2、结构和编写的规定编写。本标准由四川省林业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站本标准主要起草人：岳碧松 魏辅文 张和民 沈富军 杨旭煜 古晓东IIDB51/T 24032017野生大熊猫粪便样品采集及 DNA 提取技术规程1 范围本标准规定了野生大熊猫新鲜粪便采集和 DNA 提取技术规程。本标准适用于四川省野生大熊猫新鲜粪便样品采集和DNA提取。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB51/T 228

3、8-2016 野生大熊猫种群动态监测技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 3.1大熊猫栖息地habitats of giant panda是指适合于大熊猫生活的环境范围。3.2 3.2GISGeographic Information System地理信息系统4 采样频次、时间和样线设计4.1 采样频次与时间野生大熊猫新鲜粪便样品采集可在春季化雪后（繁殖季节）和冬季积雪前（非繁殖季节）开展；对于交通比较方便的大熊猫分布密集区，可以根据具体情况和研究目标增加采样次数。各地可根据当地大熊猫的习性以及当地的物候、气候、大熊猫主食竹发笋规律、野外工作条件和后勤保障等因素，确定具体采

4、样时间。野外采样工作应尽量在最短时间内完成，一般为10-15天。4.2 采样路线以1:5万电子地图或遥感卫星图片为基本工作图，以全国第四次大熊猫调查结果为依据，采用GIS 方法将保护区大熊猫栖息地划分为若干个面积为2 km2 的网格，每个网格作为1个采样小区，并编号。取样小区的划分尽量与全国第四次大熊猫调查保持一致。1DB51/T 24032017在单个小区内，根据地形、地貌、道路、河流、植被、大熊猫主食竹等因素，以最短的距离覆盖最多的生境类型为原则，布设实际采样路线，样线长度不得少于1.5 km，尽量形成“S”形或“Z”形路线。5 粪便样品的采集和保存方法5.1 采样工具手持终端设备、GPS

5、定位仪、罗盘、地形图、记录表格、一次性PE手套、封口袋、500ml塑料样品瓶、无水乙醇、标记笔、铅笔、标签纸、标记胶带、GPS数码照相机等。5.2 粪便新鲜程度判定以大熊猫粪便表面是否有粘液和粘液的光泽、粪便完整程度、颜色以及气味等判断大熊猫粪便的新鲜程度，其中以大熊猫粪便表面附有粘液为主要标准。1天以内：粪便颜色保持绿色或与调查季节竹子颜色相近、表面有明显粘液、且向光和贴近地面一侧的粘液光泽基本无差异。2-5天：粪便颜色与调查季节竹子颜色相近，表面有较多粘液，向光一面的光泽消失或不明显、贴近地面一侧的表面有光泽。6-10天：粪便颜色接近深绿色，表面有少量粘液，向光一面的表面无光泽。5.3 粪

6、便样品的选取原则应尽量采集5天以内的大熊猫新鲜粪便，在寒冷干燥季节，可采集6-10天的粪便样品。10天以上的粪便不采集。同一堆粪便只采集一份样品；当多堆新鲜粪便距离较近时，即使判定为同一只熊猫，也可采集多份样品，以增加DNA量，但需在记录表中加以注明。直线距离100 m以上的新鲜粪便都要进行采样，以确保DNA提取成功和充足的DNA量；若遇到大熊猫求偶交配场地（通常出现在3-5月），采集原则为近距离、高强度采样，即使粪堆较近，也应分别采集；若遇到疑似大熊猫母幼粪便样品，应分开采集粪便；依据母幼大熊猫粪便大小有明显差异作出判断。5.4 样品采集方法采集大熊猫新鲜粪便样品时，应佩戴一次性PE手套。禁

7、止直接用手拾取大熊猫粪便，以避免人为因素导致的样品污染；每次采样时必须更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。直接剥取新鲜粪便的粘液表层放入盛有无水酒精的样品瓶中，拧紧瓶盖后上下用力摆动数次，使样品得到充分湿润，并检查是否有液体渗漏。贴上样品标签纸，写上样品编号和坐标，最后在样品瓶外套一层封口袋，并再次写上样品编号，以避免酒精漏出导致编号丢失。如果符合采样条件的粪便仅有少数几团时，应尽量多取一些粘液表层及浅层样品，确保能够获得充足的DNA量。如果符合采样条件的粪便是一堆或多堆时，应采集最新鲜和靠近中间的粪团样品，以避免边缘污染。同一堆粪便要尽量多取样品，如果样品瓶容量有限，可以在用力摆动洗脱

8、后，用镊子取出大的粪便残渣，然后继续取样。5.5 样品记录与编号2DB51/T 24032017在采集粪便样品的同时，应填写大熊猫粪便样品采集记录表（附录A）。记录采样坐标（采用十进制）、海拔、新鲜程度及生境状况。有条件的保护区可用手持移动终端录入电子信息表，自动记录坐标和海拔，并拍摄粪便照片和生境照片；用带有GPS的数码照相机拍摄清晰的带坐标的照片。粪便样品采集编号规则为：县名首写字母（三位）+ 保护区名首写字母（两位）+采样小区编号+ 样品号，如“PWX-WL-1-F1”表示平武县王朗第1号小区内采集的第1处粪便样品（附录B）。小区内采集的多个样品依次按照F1、F2、F3的顺序编号。晚上回

9、到宿营地后，必须对当日采样记录进行整理，核对样品编号与记录表编号是否一致，检查记录内容是否完整无误，并及时纠正补充。5.6 样品的临时保存野外样品采回后，应仔细检查核对标签和记录，并补充酒精量至样品完全浸没为宜。酒精中的样品可以室内常温保存；有条件时可进行冷藏或冷冻保存，直到样品送到相关实验室。5.7 样品的运输和实验室保存野外样品采集完成后应于10日内送到相关分子生物学实验室进行保存，并尽快进行DNA提取工作； 由于无水乙醇是易燃易爆的化学品，样品应通过专用汽车运送，并注意车内通风，禁止车内吸烟。运输过程中样品应远离火源，避免挤压。样品DNA提取和保存方法5.8 粪便样品的 DNA 提取从大

10、熊猫粪便中提取DNA，推荐使用粪便DNA提取专用商品试剂盒，具体方法参考试剂盒使用说明。5.9 DNA 的保存将装有总DNA的离心管保存在-20 冰箱备用；或在-80 超低温冰箱中长期保存。3DB51/T 24032017附录A（规范性附录）大熊猫粪便样品采集记录表 保护区大熊猫粪便样品采集记录表采样人：采样日期：天气：小区编号样品编号新鲜度（天）北纬（十进制）东经（十进制）海拔(m)取样团数生境简述1F01F022F01F024DB51/T 24032017附录B（规范性附录）四川各保护区大熊猫粪便样品编号保护区名称市县名编号四川千佛山国家级自然保护区安县AX-QFS-四川蜂桶寨国家级自然保

11、护区宝兴县BXX-FTZ-四川小寨子沟国家级自然保护区北川县BCX-XZZ-四川片口自然保护区北川县BCX-PK-四川鞍子河自然保护区崇州市CZS-AZH-四川黑水河自然保护区大邑县DYX-HSH-四川龙溪-虹口国家级自然保护区都江堰市DJY-LXHK-四川黑竹沟国家级自然保护区峨边县EBX-HZG-四川马鞍山大熊猫自然保护区甘洛县GLX-MAS-四川贡嘎山国家级自然保护区甘孜州GZZ-GGS四川瓦屋山自然保护区洪雅县HYX-WWS-四川金口河八月林大熊猫保护区金口河区JKH-BYL-四川湾坝自然保护区九龙县JLX-WB-四川九寨沟国家级自然保护区九寨沟县JZX-JZG-四川白河自然保护区九寨

12、沟县JZG-BH-四川勿角自然保护区九寨沟县JZG-WJ-四川贡杠岭自然保护区九寨沟县JZG-GGL-四川麻咪泽自然保护区雷波县LBX-MMZ-四川米亚罗自然保护区理县LX-MYL-四川马边大风顶国家级自然保护区马边县MBX-DFD-四川宝顶沟自然保护区茂县MX-BDG-四川九顶山自然保护区茂县MX-JDS-四川美姑大风顶国家级自然保护区美姑县MGX-DFD-四川冶勒自然保护区冕宁县MNX-YL-四川芹菜坪自然保护区沐川县MCX-QCP-四川白水河国家级自然保护区彭州市PZS-BSH-四川王朗国家级自然保护区平武县PWX-WL-四川雪宝顶国家级自然保护区平武县PWX-XBD-四川小河沟自然保护区平武县PWX-XHG-四川余家山自然保护区平武县PWX-YJS-四川老君山国家级自然保护区屏山县PSX-LJS-四川唐家河国家级自然保护区青川县QCX-TJH-四川东阳沟自然保护区青川县QCX-DYG-四川毛寨自然保护区青川县QCX-MZ-5DB51/T 24032017保护区名称市县名编号四川包座自然保护区若尔盖县REG-BZ-四川栗子坪国家级自然保护区石棉县SMX-LZP-四川白羊自然保护区松潘县SPX-BY-四川龙滴水自然保