第十五章基因治疗1

1、zhejiang provincial key lab of medical genetics基因治疗基因治疗gene therapy温州医学院生命科学院温州医学院生命科学院分子生物学分子生物学 第六章第六章zhejiang provincial key lab of medical genetics 第一节第一节 基因治疗的概念及其策略基因治疗的概念及其策略 第二节第二节 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序 第三节第三节 基因治疗的现状基因治疗的现状 第四节第四节 基因治疗的靶向性基因治疗的靶向性 第五节第五节 基因治疗存在的问题基因治疗存在的问题 第六节第六节 基因治疗未来产业的展望基因

2、治疗未来产业的展望主要内容主要内容zhejiang provincial key lab of medical genetics 狭义概念狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 第一节 基因治疗的概念及其策略一、基因治疗（一、基因治疗（ gene therapy ）概念）概念zhejiang provi

3、ncial key lab of medical genetics 基因矫正基因矫正 基因置换基因置换 基因增补基因增补 基因失活基因失活 “ “自杀基因自杀基因”的应用的应用 免疫基因治疗免疫基因治疗 耐药基因治疗耐药基因治疗 特异性细胞杀伤性基因治疗特异性细胞杀伤性基因治疗 生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗 第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics（1 1）基因矫正（）基因矫正（gene correctiongene correction）对于致病基因中对于致病基

4、因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2 2）基因置换（）基因置换（gene replacementgene replacement）用正常基因在原用正常基因在原位替换致病基因，使细胞位替换致病基因，使细胞dnadna完全恢复正常状态；完全恢复正常状态； （3 3）基因增补（）基因增补（gene augmentationgene augmentation）将正常基因导将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。，但致病基因未

5、去除。 第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics（4 4）基因失活（）基因失活（gene inactivationgene inactivation）：）： 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与补作用与mrnamrna结合，阻断肿瘤细胞中基因的结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义反义rna:rna: 干扰干扰mrnamrna的互补的互补rna;rna; 反义反义dna:

6、dna: 干扰干扰dnadna的互补的互补dna.dna.第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics（5 5）“自杀基因自杀基因”的应用的应用 自杀基因自杀基因 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因自杀基因”。 自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。自杀基

7、因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。但对正常细胞则无伤害作用。 第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics（6 6）免疫基因治疗）免疫基因治疗 将某些细胞因子（将某些细胞因子（il-2il-2、gm-csfgm-csf等）基因导入等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （7 7）耐药基因治疗）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而

8、使患者能耐受更大剂量的化因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。疗。第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics（8 8）化疗保护性基因治疗）化疗保护性基因治疗向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使正常细胞耐化疗药物的能力大大提高。基因，使正常细胞耐化疗药物的能力大大提高。（9 9）特异性细胞杀伤性基因治疗）特异性细胞杀伤性基因治疗利用利用dnadna重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的重组技术构建以特异

9、性杀伤靶细胞为目标的“神奇弹头神奇弹头”（1010）生殖细胞基因治疗）生殖细胞基因治疗 生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗第一节 基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略zhejiang provincial key lab of medical genetics 第二节第二节 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序1.1.目的基因的选择和制备目的基因的选择和制备 2.2.基因的转运基因的转运 3.3.靶细胞的选择靶细胞的选择 4.4.细胞转染细胞转染 5.5.外源基因的表达及检测外源基因的表达及检测 第二节 基因治疗的基本程序zhej

10、iang provincial key lab of medical genetics在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对特定基因。如对单基因缺陷遗传病单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；因即可用于治疗；对于肿瘤对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组用酶切或探针杂交法从基因组dnadna文库获

11、得，从文库获得，从cdnacdna文库文库 获取，获取，pcrpcr扩增，人工合成等。扩增，人工合成等。第二节 基因治疗的基本程序一、目的基因的选择和制备一、目的基因的选择和制备zhejiang provincial key lab of medical genetics基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体病毒载体和非病毒载体。病毒载体病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关：逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、痘苗

12、病毒载体、病毒、痘苗病毒载体、hivhiv病毒载体、杆状病毒载体等病毒载体、杆状病毒载体等 非病毒载体：非病毒载体：脂质体、分子耦联载体、裸露脂质体、分子耦联载体、裸露dnadna、染色、染色体载体、多聚物体载体、多聚物 ：与病毒载体的与病毒载体的主要区别主要区别在于：采用理化方法将治疗基在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。因转移入患者体内。第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical geneticsltrltrgagpolenv逆转录病毒载体逆转录病毒载体1 1、逆转录病毒载体的结构、逆转录病毒载

13、体的结构第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics在包装细胞中包装成假病毒在包装细胞中包装成假病毒ltrneultramprori e第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）二、基因的转运（逆转录病毒载体）zhejiang provincial key lab of medical genetics逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点（1 1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2 2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；

14、）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3 3）感染靶细胞后不扩散；）感染靶细胞后不扩散；（4 4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5 5）不感染非增殖细胞。）不感染非增殖细胞。第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）二、基因的转运（逆转录病毒载体）zhejiang provincial key lab of medical genetics同时也存在一定的缺点同时也存在一定的缺点: : 容量小，只能容纳容量小，只能容纳8 810kb10kb的外源基因片段；的外源基因片段； 血清补体能使之失活；血清补体能使之失活； 病毒滴度低，低于治疗大

15、肿瘤需要的滴度；病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度； 病毒整合到病毒整合到dnadna后，可能引起插入突变和激后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；活癌基因的可能； 宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。上有一定局限性。第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）二、基因的转运（逆转录病毒载体）zhejiang provincial key lab of medical genetics 腺病毒载体腺病毒载体 1 1、结构、结构e1a e1be2be2ae4e3l1l5第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运

16、zhejiang provincial key lab of medical genetics2、腺病毒载体、腺病毒载体特点特点（1 1）宿主范围广）宿主范围广（2 2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3 3）可获得高病毒效价）可获得高病毒效价（4 4）重组体非常稳定）重组体非常稳定（5 5）不会引起肿瘤）不会引起肿瘤（6 6）有较高的安全性）有较高的安全性（7 7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8 8）不整合入染色体）不整合入染色体第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（腺病毒载体）二、基因的

17、转运（腺病毒载体）zhejiang provincial key lab of medical genetics3 3、腺病毒载体腺病毒载体优点优点（1 1）能够进行位点特异性整合）能够进行位点特异性整合（2 2）无致病性）无致病性（3 3）载体结构简单）载体结构简单（4 4）稳定）稳定（5 5）不引起肿瘤形成）不引起肿瘤形成（6 6）腺相关病毒特别适合在活体条件下将基因）腺相关病毒特别适合在活体条件下将基因 转入特定的靶细胞，同时又不诱发机体对转入特定的靶细胞，同时又不诱发机体对 被感染细胞产生免疫反应被感染细胞产生免疫反应 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（腺病毒载体）二、基因的转

18、运（腺病毒载体）zhejiang provincial key lab of medical genetics单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体a b u1 bacus c a2 2、特点、特点（1 1）滴度高）滴度高（2 2）容量大）容量大（3 3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4 4）不整合，但可长期存在并可稳定表达）不整合，但可长期存在并可稳定表达1 1、结构、结构第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics痘苗病毒载体痘苗病毒载体 线形双链线形双链dnad

19、na的有包膜病毒的有包膜病毒 ，其核心颗粒不依赖，其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时。同时痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力，可响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一或不允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。源蛋白。 缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系 统灭活并降解统灭活并降

20、解 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics艾滋病病毒艾滋病病毒(hiv)(hiv)载体载体 优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体 免疫系统的监视，从而防止免疫排斥免疫系统的监视，从而防止免疫排斥 缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞 的毒性和产生变种病毒的毒性和产生变种病毒 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang pro

21、vincial key lab of medical genetics杆状病毒载体杆状病毒载体 节肢动物为唯一宿主的病毒，节肢动物为唯一宿主的病毒， 杆状病毒对哺乳动物杆状病毒对哺乳动物是高度安全的。重组杆状病毒作为基因转移载体应是高度安全的。重组杆状病毒作为基因转移载体应用于哺乳动物细胞已经得到广泛的证实。用于哺乳动物细胞已经得到广泛的证实。 可可插入大片段，容易得到高滴度的病毒粒子和无插入大片段，容易得到高滴度的病毒粒子和无细胞毒性细胞毒性等优点。许多经过遗传修饰的病毒还具等优点。许多经过遗传修饰的病毒还具有有高转导效率和较广泛的宿主范围高转导效率和较广泛的宿主范围的优点的优点 第二节 基

22、因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical geneticszhejiang provincial key lab of medical genetics脂质体脂质体 脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装dna dna 后形成后形成的脂质体的脂质体-dna-dna复合物。脂质体载体复合物。脂质体载体无毒无抗原性无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，以免受核酸酶降解，容量大容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静可单独或联合其他载体使

23、用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位脉注射使目的基因进入特定部位。 缺点：缺点：表达时表达时间短，不能通过细胞膜屏障间短，不能通过细胞膜屏障 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics分子耦联载体分子耦联载体 分子耦联载体由分子耦联载体由dnadna、dnadna结合因子和配体三结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。 缺点：缺点：dnadna易

24、被降解，降低了基因转移效率；易被降解，降低了基因转移效率； 靶向性不高靶向性不高 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的电荷的dnadna相结合，形成稳定的多聚复合物，使相结合，形成稳定的多聚复合物，使dnadna不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。 多聚物载体多聚物载体聚合物聚乙烯亚氨聚合

25、物聚乙烯亚氨(pei)(pei) ：peipei分子量的增加，其分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；聚乙二醇聚乙二醇(peg) (peg) ：降低降低peipei的毒性的毒性 ；聚聚d d，l22l22，4242二氨基丁酸二氨基丁酸(pdba)(pdba) ：一种新型多聚：一种新型多聚物基因载体物基因载体 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics裸露质粒裸露质粒dna dna 将裸露质粒将裸露质粒dnadna直接注入肌肉，外源基因直接注

26、入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。成正比，与溶液体积无关。 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics染色体载体染色体载体一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而

27、发挥作用。均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的转座子是一类小的dnadna片段，可以在片段，可以在染色体不同的染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics1.1.细胞转导肽细胞转导肽( transduction pep tide) ( transduction pep tide) 介导基因导入系

28、统介导基因导入系统 蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽多肽- -细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。在一定程度上限制了它的应用。 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（其他新型载体二、基因的转运（其他新型载体 ）zhejiang pro

29、vincial key lab of medical genetics2. 2. 纳米微生物技术基因治疗载体纳米微生物技术基因治疗载体纳米微生物具有纳米微生物具有许多优点许多优点：1)1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞；的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞； 2)2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细

30、胞产生毒性；会对细胞产生毒性； 3)3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；速度，延长其治疗效果； 4)4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运（其他新型载体二、基因的转运（其他新型载体 ）zhejiang provincial

31、 key lab of medical genetics基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。 第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的

32、转运zhejiang provincial key lab of medical genetics人类基因治疗中，将治疗基因导入细胞有两种途径。人类基因治疗中，将治疗基因导入细胞有两种途径。一种为一种为直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo）： 即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种为另一种为间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）： 即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体

33、内，达到治疗目的。体内，达到治疗目的。第二节 基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运zhejiang provincial key lab of medical genetics选择靶细胞的选择靶细胞的原则是原则是：1 1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体 分离又便于输回体内；分离又便于输回体内；2 2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至 几年，最后可延续至病人的整个生命期；几年，最后可延续至病人的整个生命期；3 3）易于受外源遗传物质的转化；）易于受外源遗传物质的转化；4 4）在选用反转录病毒载

34、体时，目的基因表达最）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最 好具有组织特异性的细胞好具有组织特异性的细胞 。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。 第二节 基因治疗的基本程序三、靶细胞的选择三、靶细胞的选择 zhejiang provincial key lab of medical genetics 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒dna直接转移法直接转移法磷酸钙法deae葡聚

35、糖法电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics1 1）物理方法）物理方法（1）电穿孔法电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的孔。周围基质中的dna可渗进细胞，进而表达。可渗进细胞，进而表达。 细胞细胞 细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲高压脉冲 dna渗入细胞渗入细胞瞬间瞬间第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转

36、染zhejiang provincial key lab of medical genetics利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核 （2 2）显微注射法（）显微注射法（microinjection microinjection ）第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics例：转基因动物的制备例：转基因动物的制备 重组基因重组基因 dna 微注射微注射 （体外）（体外） 小鼠受精卵小鼠受精卵 回植回植 假妊娠假妊娠 仔仔 鼠鼠 动物模型：转基

37、因鼠动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)zhejiang provincial key lab of medical geneticszhejiang provincial key lab of medical geneticszhejiang provincial key lab of medical genetics 利用亚微粒的利用亚微粒的钨和金钨和金能吸附能吸附dnadna，并将其包裹起来，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移

38、目的基因的目的，而既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。不损伤靶细胞。 该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。等细胞中表达。（3 3）微粒子轰击法）微粒子轰击法第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法： 目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的dnadna微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组

39、中，在适当条件下得以表达。体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。2 2）化学法）化学法第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics磷酸钙磷酸钙+dna 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉淀物中暴露 524h 方法简单，但转化效率低方法简单，但转化效率低。第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical geneticsdnadna脂膜脂膜peg仙苔病毒仙苔病毒细胞融合细

40、胞融合转化细胞转化细胞应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构- -脂质体，脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源包装外源基因，再与靶细胞融合，外源dnadna导入导入靶细胞，使其表达。靶细胞，使其表达。3 3）脂质体法（）脂质体法（liposomeliposome）第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics同源重组（同源重组（homologus recombinationhomologus recombination）: :外源基因和外源基因和染色体上的基因在

41、同源序列间发生重组而插入染色体。染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。 单交换单交换双交换双交换4 4）同源重组法）同源重组法第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics通过同源重组定点插入珠蛋白基因通过同源重组定点插入珠蛋白基因 重组后，插入外源基因片段带有重组后，插入外源基因片段带有neoneo基因基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neoneo 的培养基中生长，没有

42、插入新基因的细胞死亡，的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。将有重组的细胞筛选出来。第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical geneticsxba ibstxixba ineoxbaibstxineo正常基因座位正常基因座位带有珠蛋白基带有珠蛋白基因的质粒因的质粒第二节 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染zhejiang provincial key lab of medical genetics感染细胞感染细胞重组病毒5 5）病毒介导基因内转移）病毒介导基因内转移第二节

43、 基因治疗的基本程序四、细胞转染四、细胞转染是通过病毒为载体（是通过病毒为载体（vectorvector），将外源基因通过重组），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞技术与病毒重组，然后去感染受体细胞zhejiang provincial key lab of medical genetics在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，northrnnorthrn杂交，杂交，rnarna打

44、点杂交，免疫组织化学染色等，打点杂交，免疫组织化学染色等， 第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics分子杂交与印迹技术的原理分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在dna复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同dna单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把dna与与rna放在一放在一起，只要在起，只要在dna或或rna的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的碱基配对关系，

45、就可以在不同的分子之间形的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex) 。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics复性复性rnadna第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics印渍技术印渍技术 (blotting) 首先由edwen southern在1975年提出。 blotting即“印渍”，指

46、将存在于凝胶中的生物 大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以 检测分析的技术，目前广泛应用于dna、rna、 和蛋白质的检测第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics探针技术探针技术 (probe)将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为记，称为“探针探针”然后用于分子杂交，杂交后通过然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或

47、显色技术，使杂交区带放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来显现出来 第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics理想探针标记的特性理想探针标记的特性1. 1. 高灵敏度；高灵敏度；2. 2. 与探针的结合不能影响该分子的结构；与探针的结合不能影响该分子的结构；3. 3. 与探针的结合不影响探针的主要理化性质；与探针的结合不影响探针的主要理化性质；4. 4. 用酶促方法标记时，应该不影响酶促反应；用酶促方法标记时，应该不影响酶促反应；5. 5. 标记后的检测方

48、法具有高灵敏度和高特异性；标记后的检测方法具有高灵敏度和高特异性；6. 6. 具有化学稳定性、检测方便、无毒、无环境污染。具有化学稳定性、检测方便、无毒、无环境污染。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical geneticsdna印迹技术印迹技术又称为又称为southern杂交，即杂交，即dna-dna杂交分析。杂交分析。是研究是研究dna图谱的基本技术，主要用于基因组图谱的基本技术，主要用于基因组dna的分析，如在基因组中特异基因的定位及的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，

49、亦可用于分析重组质粒和噬菌体。检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在在遗传诊断遗传诊断dna图谱分析及图谱分析及pcr产物分析等方面产物分析等方面有重要价值。有重要价值。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics1. 将将dna标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶 电泳分离各酶解片段；电泳分离各酶解片段；2. 经碱变性，经碱变性，tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将 dna从凝胶中转印至硝

50、酸纤维素滤膜上，烘干固定，从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定， 凝胶中凝胶中dna片段的相对位置在片段的相对位置在dna片段转移到滤膜的片段转移到滤膜的 过程中继续保持着过程中继续保持着;3. 附着在滤膜上的附着在滤膜上的dna与与32p标记的探针杂交，利用放射标记的探针杂交，利用放射 自显影术确定探针互补的每条自显影术确定探针互补的每条dna带的位置，确定在众带的位置，确定在众 多酶解产物中含某一特定序列的多酶解产物中含某一特定序列的dna片段的位置和大小。片段的位置和大小。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincia

51、l key lab of medical genetics（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组dnadna限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因dna片段片段x光底片光底片zhejiang provincial key lab of medical genetics第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical geneticsrna印渍技术印渍技术又称为又称为northern杂交，即杂交，即rna-dna杂交分析杂交分析;是一种将是一种

52、将rna从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mrna的表达水平以及比较不同组织和细胞的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。的同一基因的表达情况。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics蛋白质印渍技术蛋白质印渍技术又称为又称为western杂交，或免疫印渍技术，即利用杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤

53、维素膜上的抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。子的相互作用研究等。 第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较zhejiang provincial key lab of medical genetics（一）（一）dnadna

54、印迹技术印迹技术 (southern blotting)(southern blotting) 用于基因组用于基因组dnadna、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）rnarna印迹技术印迹技术 (northern blotting)(northern blotting) 用于用于rnarna的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (western blotting)(western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基

55、因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics斑点印迹斑点印迹斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。上可同时检测多个样品。 第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表

56、达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics原位杂交原位杂交即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与增加，让探针进入细胞内与dna或或rna杂交。杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。学意义。第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达

57、及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics菌落杂交菌落杂交第二节 基因治疗的基本程序五、外源基因的表达及检测五、外源基因的表达及检测 zhejiang provincial key lab of medical genetics第三节、基因治疗的现状第三节、基因治疗的现状 进行基因治疗必须具备下列条件：进行基因治疗必须具备下列条件：1)1)选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因 的结构功能了解清楚；的结构功能了解清楚；2)2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达纠正

58、该病的基因已被克隆，并了解该基因表达 与调控的机制与条件；与调控的机制与条件；3)3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4)4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用 的动物模型。的动物模型。 zhejiang provincial key lab of medical genetics 19911991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶酶adaada基因缺陷）的女孩体内导入重组的基因缺陷）的女孩体内导入重组的adaada基因，获得成基

59、因，获得成功功 19921992年实施了年实施了tnftnf肿瘤细胞和肿瘤细胞和ilil2/2/肿瘤细胞方案，即分肿瘤细胞方案，即分别将别将ilil2 2基因肿瘤坏死因子（基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis rectortumor necrosis rector， tnftnf）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，结果）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，结果5 5名黑色素瘤病人中名黑色素瘤病人中1 1名肿瘤完全消退，名肿瘤完全消退，2 2名名90%90%的肿瘤消退，的肿瘤消退，另另2 2人在治疗后人在治疗后9 9个月死亡。个月死亡。 我国也在我国也在19941994年用导

60、入人凝血因子年用导入人凝血因子基因的方法成功治疗基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者了乙型血友病的患者 对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。索中。 第三节、基因治疗的现状 zhejiang provincial key lab of medical geneticsada-gene + vector （逆转录病毒）（逆转录病毒） 重组分子重组分子 患者患者t ly c il-2刺激刺激c分裂分裂 导入导入 细胞生长分裂细胞生长分裂 10天天 gene表达表达 回输患儿体内回输患儿体内 12月治疗一次月治疗一次, 10个月个月