免疫酶组织化学技术

1、免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 第一节第一节 基基 本本 原原 理理 抗原抗原抗体（特异性）抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的定位组织或细胞内抗原的一门技术。一门技术。免疫酶组化免疫酶组化 免疫学免疫学(抗原抗体反应抗原抗体反应) 酶细胞化学酶细胞化学(底物显色反应底物显色反应)+特异性特异性 敏感性敏感性 定位性定位性 可视性可视性pap法法免疫酶组织化学基本组成：免疫酶组织化学基本组成：抗原抗原 抗体抗体 放大系统放大系统 显色系统显色系统abc法法免疫酶特点：免疫酶特点： 信号定位准确信号定位

2、准确 标本可长期保存标本可长期保存 阳性标记与病变关系阳性标记与病变关系 方法简便，易推广方法简便，易推广 一、酶及其特点一、酶及其特点 酶选择标准：酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。定位。第二节第二节 酶酶 和和 底底 物物 酶易于纯化，获得纯制品。酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在酶在ph中性液内较稳定。中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。组织中不应存在与底

3、物作用的内源性酶。符合上述条件：符合上述条件： 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（hrp） 分子量（分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色可作用于多种底物，产生不同颜色 hrp穿透力强，易进入细胞内穿透力强，易进入细胞内 （二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（akp） 从小牛

4、肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱组织穿透能力较弱 内源性内源性akp较高较高 左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 （三）葡萄糖氧化酶（三）葡萄糖氧化酶（godgod） 底物为葡萄糖，终产物稳定底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性体内无内源性god 分子量大，穿透力较弱分子量大，穿透力较弱 二、底物及其特点二、底物及其特点 酶酶底物底物酶酶底物底物酶酶产物（显色）产物（显色）hrp的底物：的底物： hrp的底物为低浓度的的底物为低浓度的h2o2，供氢体为胺类及酚类化合物。供氢体为胺类及酚类化合物。 hrp显色反应：显色反应： hrph2o2 hrph2

5、o电子供体（氧化型）电子供体（氧化型） 电子供体电子供体 电子供体被氧化后，迅速改变电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。性有色颗粒，并就地原位沉淀。hrp常用的电子供体：常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺(dab)棕色棕色 氨乙基卡巴唑氨乙基卡巴唑(aec)红色，易溶于有机溶剂，红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯氯-1-茶酚（茶酚（4cn）蓝色，易弥散，不能久保）蓝色，易弥散，不能久保存存 3.3，5.5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(tmb) 黄色黄色akp底

6、物：底物： akp常用的底物为常用的底物为-萘酚萘酚as-b1磷酸盐磷酸盐 偶联试剂：偶联试剂：固兰固兰bb蓝色蓝色 固红固红tr红色红色 第三节第三节 酶标记抗体法酶标记抗体法 酶标记抗体法（酶标记抗体法（enzayme labelled antibody）是将酶通过共价键结合在）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。过抗体去寻找相应抗原。 一、直接法一、直接法原理：原理：hrp标记在特异性抗体标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原（第一抗体）上，抗原- 抗体抗体 hrp复合物复合物组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物

7、酶过氧化物酶直接法直接法步骤：步骤：一步完成一步完成特点：特点：方法简便、省时，专一方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻，性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。抗体只能检测一种抗原。二、间接法二、间接法原理：原理：hrp标记在第二抗体上，标记在第二抗体上， 抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体二抗体 hrp复合物复合物步骤：步骤：二步法二步法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法特点：特点：敏感性较直接法高，一敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性

8、动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特但较直接法费时，非特 异染色稍重。异染色稍重。 第四节第四节 酶酶 抗抗 酶酶 法法 制备抗酶抗体制备抗酶抗体 制备制备pap复合物复合物酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）第三抗体（抗酶抗体）hrp一、一、pap法法原理：原理：抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体（桥抗体）二抗体（桥抗体）- pap复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体pap复合物复合物pap法法hrp特点：特点： 敏感性较高，背景染色较轻敏感性

9、较高，背景染色较轻 但特异性抗体与但特异性抗体与pap必须为必须为 同一种属动物同一种属动物 二、双二、双pappap法：法：原 理 ：原 理 ： 在在 p a p 的 基 础 上 再 重 复的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和第二抗体和pap复合物复合物抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第二抗体（桥抗第二抗体（桥抗体）体）-pap -第二抗体第二抗体- pap复合物复合物 组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体pap复合物复合物双双pap法法hrp双双pap法法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体pap复合物复合物hrp步骤：步骤：五步法五步法 特点：特点：敏感性较高敏

10、感性较高缺点：缺点：但步骤多，费时，非特但步骤多，费时，非特 异背景重异背景重三、三、apaapapaap法法原理：原理：抗原抗原-特异抗体特异抗体-第二第二 抗体抗体- apaap复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法apaap法法特点：特点：非特异背景较轻，不受内非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂但产物易溶于有机溶剂 第五节第五节 卵白素卵白素-生物素生物素avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成亚基组成biotin小分子维生素小分子维生素avidin和和biotin具有较高亲和力具有较高亲和力一一 、abc法法 a

11、vidin biotin complex原理：原理：酶标记酶标记biotin形成酶素化形成酶素化 biotin 酶素化酶素化biotinavidin - abc 复合物复合物 抗原抗原-特异抗体特异抗体- biotin标记标记 第二抗第二抗- avidin biotin hrp 组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体hrp生物素生物素卵白素卵白素abc法法步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性较高，特异性强，敏感性较高，特异性强， 应用范围广应用范围广 某些脏器存在内源性生物素某些脏器存在内源性生物素 干扰干扰 avidin与核酸及细胞膜中磷脂与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应有

12、非特异反应sabc法法 streptavidin biotin peroxidase complex sabc法已代替法已代替abc法法 二、二、lsab法法 labelled streptavidin biotin method原理：原理： biotin标记第二抗体标记第二抗体lsab法法 hrp标记标记avidin 抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-biotin标记标记第二抗体第二抗体-avidin hrp复合物复合物 步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性高，特异性强，敏感性高，特异性强， 方法简便方法简便第六节第六节 多聚合物酶法多聚合物酶法 hrp-hrp-多聚合物多聚合物-抗体抗

13、体 一、一、epos法法 enhanced polymer one-step staining多聚合物酶法多聚合物酶法组织抗原组织抗原一抗一抗hrp多聚骨架多聚骨架epos 方法方法原理：原理：采用一种具有惰性的多聚采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异化合物作为骨架，将特异 性抗体和性抗体和hrp，同时标记，同时标记 在多聚合物分子上，形成在多聚合物分子上，形成 hrp-多聚合物多聚合物-特异性特异性 抗体。抗体。 步骤：步骤：一步法一步法特点：特点：快速，简便，特异性强，快速，简便，特异性强， 敏感性高敏感性高 但商品化种类不全，但商品化种类不全， 价格昂贵价格昂贵二、二、envi

14、sion法法 enhanced labelled polymer system原理：原理：hrp -多聚合物多聚合物-第二第二 抗体抗体组织抗原组织抗原一抗一抗二抗二抗酶酶多聚骨架多聚骨架第一步第一步第二步第二步envisiontm方法方法特点：特点：敏感性高：敏感性高：（1 mole复合物中含复合物中含70mole hrp和和10 mole第二抗体）第二抗体） 特异性强：特异性强： 复合物内无内源性复合物内无内源性avidin和和biotin的干扰。的干扰。第七节第七节 基本操作步骤基本操作步骤 1. 抗原修复抗原修复2.内源性过氧化内源性过氧化物抑制物抑制3. 正常血清封闭正常血清封闭4. 第一抗体第一抗体5. 第二抗体第二抗体6. 酶标记体酶标记体7. dab- h2o2显色显色第八节第八节 抗原定位及非特异染色抗原定位及非特异染色 组织细胞组织细胞 固定问题固定问题 脱蜡不彻底脱蜡不彻底 内源性过氧化物内源性过氧化物