质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳分离DNA

1、1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 l限制性内切酶切割出目的dnal了解琼脂糖凝胶电泳的原理l掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法 l利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒dna。l琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的dna（如用肉眼观察，可检测到10 ng的dna），且检测的范围很广。pbc sk mappbc sk mapl它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当dna样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入dna分子中形成络合物，使

2、dna在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于dna的含量，这样就可以检测dna的浓度。（一） 仪器 l1. 水平式凝胶电泳槽 l2. 稳压电泳仪 l3. 电炉 l4. 紫外检测仪 l5. 台式离心机 （二） 材料 l实验一中提取的质粒dna和酶切后的质粒dna。 （三）（三） 试剂试剂 l1.限制性内切酶 ecori，l2. tae电泳缓冲液(50) （ph8.0） tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/l edta（ph8.0） 100ml l3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 l4. 10dna样品上样缓冲

3、液 l5. 琼脂糖酶切体系l调制酶切体系如下: (共 20l) 无菌水 6l， 质粒 10 l buffer k 2l, ecor i 1l, bamh i 1 l 37酶切1.5小时。 l1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 l2. 插好挡板、梳子。 l3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1tae）。 l4. 加热煮沸，使琼脂糖完全完全溶解。 l5. 溶液冷至约60时，加入溴化乙锭4 l (终浓度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。l6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出

4、梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。 l7. 加入电泳缓冲液（1tae）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。l 8.在dna样品中加入2 l (1/10体积)的10 dna上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 l9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。l10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120v，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 l11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 l12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 l13. 根据需要切下dna条带，放入1.5ml ep管中，放于4保存，以备下周实验用。l质粒dna在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。l如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。l影响re(限制性内切酶)活性的主要因素：dna的纯度；dna的甲基化程度；温度；缓冲液成分（ddt，bsa）等。使用3 mg的dna marker dl2,0