生物化学经典实验纸层析法分析氨基酸

1、一、实验目的一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。 纸上层析法是分配层析法中的一种，常以纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代操作方便，使用样品少，

2、分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。用于科研和生产分析工作中。 常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相的水相, , 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力, , 其吸附的其吸附的水相为固定相水相为固定相, , 有机溶剂相为有机溶剂相为移动相移动相。 由于物质的极性大小不同由

3、于物质的极性大小不同, ,在两相中分配比例在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多, ,随随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多较多, ,移动相对较慢移动相对较慢, ,从而将极性不同的物质分开从而将极性不同的物质分开 在相同的条件下，每种物质都有其固定在相同的条件下，每种物质都有其固定的的rf值。值。 rf值的定义为：值的定义为： 原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离 rf = 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离影响影响rf值的因素有：值的因素有： 物质本身的化学结构；

4、物质本身的化学结构； 展层所用溶剂系统；展层所用溶剂系统； 展层剂展层剂ph值；值； 展层时的温度；展层时的温度； 展层所用滤纸；展层所用滤纸； 展层的方向展层的方向(横向，上行或下行横向，上行或下行)。用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献条件，根据文献rf值进行鉴定。值进行鉴定。 1、纸的处理、纸的处理 取取18 cm长、长、18 cm宽的滤纸一宽的滤纸一张，离底边张，离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离

5、的在线上定点样点的线，并等距离的在线上定点样点(原点原点)划圈，划圈，使圈的直径小于使圈的直径小于0.4 cm。 2、点样、点样 用毛细管点样，中间点混合氨基酸，用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2-3次，次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在应控制在2-4mm左右，点样完毕用大头针线将滤左右，点样完毕用大头针线将滤纸做成筒形，点样面向里。纸做成筒形，点样面向里。 图图1. 点点

6、样样 2cm 展层剂展层剂展层剂展层剂图图2. 滤纸的缝合滤纸的缝合3、平衡、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的点样以后将滤纸与层析缸用配好的溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡平衡(30min) ,否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，影响层析效果。沿，影响层析效果。 4、展层、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约向层析缸中加入层析溶剂（高约1.5cm） ，液层不要超过点样

7、线，将滤纸点样，液层不要超过点样线，将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达滤纸上边线剂到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。时取出冷风吹干。 5、显色、显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚茚三酮，热风吹干三酮，热风吹干(加快反应加快反应)反应显色反应显色(或晾干后，或晾干后，将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中80-100，烘烤，烘烤5分钟后分钟后 )，滤，滤纸上即显出纸上即显出紫红色或黄色紫红色或黄色的氨基酸斑点。的氨基酸斑点。 四、结果处理四、结果处理 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。、用铅笔将层析

8、色谱轮廓和中心点描出来。 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的rf值。值。 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。、分析混合样品中未知氨基酸的组分。图图3. 层析谱层析谱1原点；原点；2层析点；层析点；3溶剂前沿溶剂前沿五、注意事项五、注意事项 (1) 在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2) 在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3) 点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），），防止氨基酸斑点重叠。防止氨基酸斑点重叠。(4) 展